Immobilization of biomolecules into biodegradable polymeric based substrates for selective recruitment and adhesion of cells for tissue engineering applications

Abstract

Development of bioactive materials with the ability to stimulate specific cellular responses is a topic of high interest in the fabrication and development of biomaterials. The proper presentation of these biochemical regulatory signals within a biomaterial is required for tissue regeneration. Furthermore, a better understanding of cell-biomolecule-material interactions is a key step toward the creation of multicellular and hierarchically organized tissues. Therefore the major focus of the present thesis was on developing new instructive polymeric materials by immobilized specific biochemical signals. To this end, chitosan films and microparticles were functionalized with biomolecules of interest yielding biomaterials with specific chemical signals to modulate cellular performance. An important feature that a material should display for functionalization with specific biochemical cues it is the availability of chemical groups for covalent modification. The chemical nature of chitosan provides many possibilities for covalent modifications which offer several possibilities for derivatization and immobilization of biologically active species. In a first study it was pointed out the importance of the covalent immobilization method of bioactive moieties, namely fibronectin, to enhance the rate of cell adhesion and proliferation on chitosan substrates. Chitosan membranes were functionalized with fibronectin through carbodiimide chemistry. Biological results showed that the chemical functionalization with fibronectin stimulated cell attachment when compared to simple adsorption of the protein. The functionalization of chitosan substrates with molecules that target a specific cell type could be a promising strategy to isolate and recruit cells of interest to regenerate a particular tissue. Additionally microtechnologies offer unprecedented means to generate precise patterns of surface-tethered biomolecules. In this thesis the spatial control of antibodies was achieved by two different strategies: (1) microcontact printing for covalent immobilization using bis[sulfosuccinimidyl] suberate as a crosslinker; (2) photopatterning by using surfaces functionalized with photoprotected biotin that upon irradiation through a mask generate well defined patterns of activated biotin. Such substrates were then used to immobilized biotinylated antibodies via streptavidin. Different cell types, namely adipose stem cells and endothelial cells were seeded on the functional surfaces. Results from both experiments showed that cell attachment and proliferation could be easily manipulated depending on the immobilized antibody. Finally moving up to three-dimensional systems, a novel “bottom-up” approach based on the assembly of functional microparticles was developed. In chapter VII chitosan microparticles were functionalized anti-human platelet-derived growth factor (PDGF) antibody using carbodiimide chemistry. The functional particles were then investigated as a method to recruit specific growth factors from a highly enriched concentrate of growth factors – Platelet Lysates – an autologous and easily obtained source of bioactive agents capable of providing high concentrations of several proteins. Results showed that antibody-functionalized particles allowed selective recruitment of a specific growth factor from a complex mixture. It was hypothesized that stem cells can crosslink polymeric microparticles, if they contain specific ligands capable of binding to receptors on the cell surface leading to the formation of stable and robust three-dimensional structures. In vitro tests revealed that microparticles aggregate due to cell connecting points, giving rise to 3D constructs. In chapter VIII chitosan microparticles functionalized with antibodies, were explored as a method for cell separation and expansion. Results showed that the microparticles could selectively capture a particular cell type from a mixed cell population. Moreover particles were also suitable for cell expansion of the target cell type. For clinical applications, injectable/moldable hydrogels are often needed to fill defects of irregular geometries. To test the capacity of the functional microparticles as an injectable system, functional microparticles were seeded with stem cells and injected into a mold with a tubular shape. After three days of incubation in vitro, a robust piece with a tubular shape was obtained. The works developed in chapters VII and VIII reported a novel approach for the production of instructive 3D constructs based on the assembly of functional micro building blocks. These versatile microgels can be a promising way to produce injectable system for non-invasive tissue engineering applications with additional control over cellular function by creating specific microenvironments for cell growth.

O desenvolvimento de materiais biologicamente ativos com a capacidade de estimular respostas celulares específicas é um tópico de grande interesse na fabricação e no desenvolvimento de biomateriais. A apresentação adequada desses sinais reguladores bioquímicos dentro de um biomaterial é necessária para a regeneração de tecidos. Além disso, uma melhor compreensão das interações célula - biomolécula -material é um passo fundamental para a criação de tecidos multicelulares e hierarquicamente organizados. O principal objetivo desta tese consistiu no desenvolvimento de novos materiais poliméricos instrutivos através da imobilização sinais bioquímicos específicos. Membranas e micropartículas de quitosano foram funcionalizadas com biomoléculas de específicas de modo a desenvolver materiais que permitem um controlo sobre o desempenho celular. Uma característica importante que um material deve exibir de modo a ser funcionalizado com sinais bioquímicos é a disponibilidade de grupos químicos que permitam modificação. A natureza química do quitosano oferece varias possibilidades de modificação covalente para a imobilização de espécies biologicamente ativas. No primeiro trabalho desta tese, foi analisada a importância do método de funcionalização para a modificação com fibronectina de modo a aumentar a taxa de adesão e proliferação celular em substratos de quitosano. Membranas de quitosano foram funcionalizados com fibronectina por adsorção ou conjugação usando uma carbodiimida. Os resultados biológicos mostraram que a funcionalização química com carbodiimida aumenta a adesão e proliferação celular quando comparada com a modificação por adsorção. A funcionalização de substratos de quitosano com moléculas que têm como alvo um tipo específico de célula pode ser uma estratégia promissora para isolar e recrutar células de interesse para a regeneração de tecidos . Além disso diferentes técnicas de microfabricação permitem criar padrões bem definidos de biomoléculas em diferentes substratos. Nesta tese o controlo espacial de anticorpos foi conseguida usando duas estratégias diferentes: (1) impressão por microcontato para imobilização covalente utilizando bis [sulfosuccinimidil] suberato como agente de ligação, (2 ) fotolitografia usando superfícies funcionalizadas com biotina fotossensível que irradiadas através de uma máscara permitem a criação de padrões bem definidos de biotina ativada. Esses substratos foram então usados para imobilização de anticorpos biotinilados via estreptavidina. Diferentes tipos de células , nomeadamente células estaminais do tecido adiposo e células endoteliais foram cultivadas sobre as superfícies funcionais . Os resultados de ambas as experiências mostraram que a ligação de células e proliferação poderia ser facilmente manipulada dependendo do anticorpo imobilizado . Numa última fase desta tese foram explorados sistemas tridimensionais, através de uma abordagem “bottom-up”, que combina o uso de micropartículas funcionais. No capítulo VII micropartículas de quitosano foram funcionalizadas com um anticorpo. anti- fator de crescimento derivado de plaquetas humano, usando uma carbodiimide. As partículas funcionais foram então testadas como um método para o recrutamento de fatores de crescimento específicos a partir de uma solução enriquecida de múltiplos fatores de crescimento - Lisados de Plaquetas- uma fonte autóloga e de fácil obtenção de agentes bioativos, capazes de disponibilizar elevadas concentrações de várias proteínas. Os resultados mostraram que as partículas funcionalizadas com anticorpo permitem o recrutamento seletivo de um fator de crescimento específico a partir de uma mistura complexa. Foi hipotetizado que células estaminais podem reticular micropartículas poliméricas funcionalizadas com ligandos específicos capazes de se ligarem aos recetores na superfície celular levando à formação de estruturas tridimensionais. Testes in vitro revelaram que as micropartículas agregam devido a pontos de ligação celulares , dando origem a estruturas tridimensionais, estáveis e robustas. No capítulo VIII micropartículas de quitosano funcionalizadas com anticorpos, foram testadas para a separação e expansão de células. Os resultados obtidos revelaram que as micropartículas permitem capturar seletivamente um tipo de célula de uma população celular heterogénea. Além disso, as partículas foram também usadas para a expansão das células isoladas. Para aplicações clínicas, hidrogéis injetáveis/moldáveis são muitas vezes necessários para preencher defeitos de geometrias irregulares. Para testar a capacidade das micropartículas funcionais como um sistema injetável, micropartículas funcionais foram cultivadas com células estaminais e injetadas num molde de forma tubular. Após três dias de incubação in vitro, foi obtida uma estrutura sólida de forma tubular. Os trabalhos desenvolvidos nos capítulos VII e VIII exploraram uma nova abordagem para a produção de estruturas tridimensionais com sinais bioquímicos integrados através da combinação de microblocos funcionais. Estes microgeis de elevada versatilidade podem vir a traduzir-se no desenvolvimento de sistemas de elevado desempenho para a produção de sistema injetáveis para aplicações em engenharia de tecidos, criando microambientes específicos para o crescimento celular.