Nanostructured functional multilayer coatings incorporating biomimetic macromolecules for biomedical applications

Abstract

The modification of surfaces has been a key aspect in biology and biotechnology, for applications including cell expansion, biomaterials development and preparation of substrates for regenerative medicine. In this thesis, the layer-by-layer (LbL) technique was employed in the modification of surfaces for multiple purposes, namely for films with improved adhesiveness, enhanced cell adhesion, drug delivery capsules, and magnetic spatial positioning. The working hypothesis was that LbL could be used in the modification of surfaces not only planar but also three-dimensional, using solely polymeric materials from a variety of natural origins or obtained by recombinant routes. Herein, chitosan (CHI), a well-known polycation with marine origins, was used recurrently as an ingredient in various multilayer formulations, driven by intermolecular forces such as electrostatic and hydrophobic interactions. First, multilayer coatings of CHI and an adhesive bacterial exopolysaccharide, levan, were fabricated. As a control, CHI and alginate films – two marine polysaccharides often regarded as good natural adhesives – were assembled in parallel. The adhesive strength of 50 CHI/levan bilayers was determined to be about 3 times higher than the control. The adhesion of L929 cells was also higher in levan-based films. Next, CHI was used along polyanionic elastin-like recombinamers (ELRs), a recombinant class of elastin-like polymers, exhibiting the cell adhesion motif arginine-glycine-aspartic acid (RGD). Although electrostatic interactions were relied upon to construct LbL coatings, they were not the sole mechanism of buildup between CHI and ELRs. The film construction of CHI and one of nine ELRs differing in amino acid content, length and biofunctionality was followed in situ at pH 4.0 and 5.5 using a quartz-crystal microbalance. Their thicknesses were estimated using the Voigt-based model for viscoelastic films, revealing that thicker films were obtained in the presence of hydrophobic interactions between ELRs and partially neutralized chitosan, i.e., when the pH was adjusted to 5.5, near its pKa. ELR/alginate coatings were also monitored, completing a total of 36 combinations studied. The results agreed with the ones from the CHI-based films: thicker films were obtained for partially neutralized alginate, at a pH value of 4.0. Bidimensional coatings of CHI and CHI/ELR-RGD were demonstrated to be stimuli-responsive by means of wettability measurements: they exhibited a moderate hydrophobic surface but switched to an extremely hydrophilic one when temperature, pH or ionic strength were raised above 50ºC, 11, or 1.25 M, respectively. The presence of RGD enhanced the adhesion of SaOs-2 cells, in comparison to films ending either in CHI or a nonbioactive RDG analogue. CHI/ELR-RGD coatings were extrapolated to the third dimension as spherical microcapsules assembled around calcium carbonate particles. Aiming at drug administration, two mechanisms were studied: (i) simple diffusion out of the microcapsules, and (ii) cellular uptake. In the first case, release studies at 25 and 37°C with “bovine serum albumin”-loaded microcapsules demonstrated that they provided a sustained release over 14 days, but with reduced capsule permeability at physiological temperature, due to the temperature-induced molecular transition of ELRs. Furthermore, a higher numbers of layers provided an added barrier to the diffusion of the encapsulated protein. The microcapsules were also noncytotoxic towards L929 cells. In the second case, the internalization efficacy and intracellular traffic of RGD- or nonbioactive RDG-functionalized microcapsules by human mesenchymal stem cells (hMSCs) was assessed. The data suggests that microcapsules were internalized mainly through macropinocytosis and that surface functionalization did not play a significant role on this phenomenon, although intracellular processing was faster for RGD-functionalized microcapsules. Both microcapsule types were noncytotoxic toward hMSCs for microcapsule/cell ratios between 5:1 and 100:1. Finally, inspired by the complex hierarchical and compartmentalized structure of cells, liquefied alginate macroscopic spheres coated with a chitosan/alginate shell were conceived. Within this liquefied environment, rhodamine and multilayer microcapsules were confined, with the latter encapsulating further either rhodamine or magnetic nanoparticles (MNPs). At 25 and 37ºC, rhodamine when encapsulated within the inner microcapsules showed a sustained release profile, with the diffusion kinetics being even more reduced at 25ºC. The release of rhodamine encapsulated in the outer liquefied alginate compartment did not show significant differences as a function of temperature. Encapsulating MNPs within the microcapsules provided magnetic responsiveness to the whole compartmentalized device and guided mobility capability. The developed work shows that LbL is a versatile technique that provides the means to develop a wide array of systems useful in biomedical applications, from adhesive and cell seeding planar supports to three dimensional structures for smart drug delivery, guided therapies and customized microreactors as disease models and microtissue production in laboratory.

A modificação de superfícies tem sido um aspeto fundamental em biologia e biotecnologia, em aplicações como a expansão de células, desenvolvimento de biomateriais e preparação de substratos para medicina regenerativa. Neste trabalho, a técnica de camada-a-camada foi utilizada na modificação de superfícies para vários fins, como filmes com adesividade e adesão celular melhoradas, cápsulas para administração de drogas, e o posicionamento espacial magnético. A hipótese foi a de que esta técnica poderia ser utilizada na modificação de superfícies planares ou tridimensionais, usando exclusivamente polímeros obtidos de várias origens naturais ou a partir de vias recombinantes. O quitosano (CHI), um reconhecido policatião com origens marinhas, foi recorrentemente utilizado como ingrediente em várias formulações de multicamadas, impulsionado por forças intermoleculares, tais como interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Primeiro, revestimentos de CHI e um exopolissacarídeo bacteriano adesivo, levano, foram construídos. Como controlo, foram comparados com filmes de CHI e alginato – polissacarídeos marinhos considerados bons adesivos naturais. A força adesiva de 50 bicamadas de CHI/levano foi determinada como sendo cerca de 3 vezes mais elevada do que o controlo. A adesão de células L929 foi também maior em filmes contendo levano. Em seguida, CHI foi utilizado juntamente com recombinâmeros tipo-elastina (ELRs), uma classe de polímeros tipo-elastina, exibindo a sequência de adesão celular “arginina-glicina-ácido aspártico” (RGD). Embora interações eletrostáticas tenham sido invocadas para a construção de multicamadas auto-organizadas, estas não foram o único mecanismo de interação entre CHI e ELRs. A construção de filmes de CHI e um de nove ELRs diferentes em conteúdo aminoacídico, tamanho e biofuncionalidade foi monitorizado in situ a pH 4.0 e 5.5 utilizando uma microbalança de cristais de quartzo. As suas espessuras foram estimadas usando o modelo de Voigt para filmes viscoelásticos, revelando que os filmes mais espessos foram obtidos na presença de interações hidrofóbicas entre ELRs e CHI parcialmente neutralizado, isto é, quando o pH foi ajustado para 5.5, próximo do seu pKa. Filmes de ELR/alginato também foram monitorados, completando um total de 36 combinações estudadas. Os resultados obtidos estiveram em concordância com os dados dos filmes baseados em CHI: filmes mais espessos foram obtidos para alginato parcialmente neutralizado, a um valor de pH de 4.0. Através de medições de ângulos de contato, demonstrou-se que os revestimentos bidimensionais de CHI e ELR-RGD eram responsivos a estímulos: exibiram uma superfície moderadamente hidrofóbica mas converteram-se em extremamente hidrofílicas quando se aumentou a temperatura, o pH ou força iónica acima de 50ºC, 11, ou 1,25 M, respetivamente. A presença de RGD melhorou a adesão de células SaOs-2, em comparação com filmes terminados ou em CHI ou num análogo não bioativo, RDG. Os revestimentos de CHI/ELR-RGD foram extrapolados para a terceira dimensão sob a forma de microcápsulas esféricas construídas em torno de partículas de carbonato de cálcio. Com a finalidade de administração de drogas, foram estudados dois mecanismos: (i) a difusão simples para o exterior das microcápsulas e (ii) a incorporação celular. No primeiro caso, estudos de libertação a 25 e 37°C com microcápsulas contendo albumina do soro bovino demonstraram uma libertação sustentada ao longo de 14 dias, mas sendo as cápsulas menos permeáveis a uma temperatura fisiológica, devido à transição molecular dos ELRs induzida pela temperatura. Além disso, um número mais elevado de camadas proporcionou uma barreira adicional à difusão da proteína encapsulada. As microcápsulas foram também não citotóxicas para células L929. No segundo caso, a eficácia de internalização e tráfego intracelular de microcápsulas funcionalizadas com RGD ou a sequência não bioativa RDG por células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs) foi avaliada. Os dados sugerem que as microcápsulas foram internalizadas principalmente através de macropinocitose, e que a funcionalização da superfície não desempenhou um papel significativo neste fenómeno, embora o processamento intracelular tenha sido mais rápido para microcápsulas funcionalizadas com RGD. Ambos os tipos de microcápsulas foram não citotóxicas para hMSCs para rácios de microcápsula/célula entre 5:1 e 100:1. Finalmente, com inspiração na hierarquia complexa e estrutura compartimentada das células, esferas macroscópicas de alginato liquefeito revestidas com camadas de CHI/alginato foram concebidas. Dentro deste ambiente liquefeito, rodamina e microcápsulas foram confinadas, com estas últimas podendo conter ou mais rodamina ou nanopartículas magnéticas (MNPs). A 25 e 37ºC, rodamina quando encapsulada no interior de microcápsulas mostrou um perfil de libertação sustentada, sendo a cinética de difusão ainda mais reduzida a 25°C. A libertação de rodamina encapsulada no compartimento externo de alginato não exibiu diferenças significativas em função da temperatura. MNPs encapsuladas dentro das microcápsulas providenciaram resposta magnética a todo o dispositivo compartimentado e capacidade de mobilidade dirigida. O trabalho aqui desenvolvido mostra que a técnica de modificação camada-a-camada é uma técnica versátil capaz de fornecer meios para desenvolver uma ampla gama de sistemas úteis em aplicações biomédicas, desde suportes planos adesivos e para adesão celular até estruturas tridimensionais para a administração “inteligente” de drogas, terapias guiadas e microreatores personalizados para o desenvolvimento de modelos de doenças e produção de microtecidos em laboratório.