Incorporation of elastase inhibitor in silk fibroin nanoparticles for transdermal delivery

Abstract

Human neutrophil elastase, as inflammatory response, has the capacity to degrade collagen and elastin component of extracellular matrix, being extensively involved in wrinkles formation induced by UV radiation damage. In order to develop a cosmetic antiwrinkling emulsion, we incorporated a potent synthetic HNE inhibitor, sivelestat (IC50 = 44 nM, Ki = 0.2 μM), into biopolymeric nanoparticles prepared by high-energy emulsification methods. As nanomaterial was used Bombyx mori silk fibroin protein, an FDA approved natural biocompatible and biodegradable polymer. Silk fibroin nanoparticles (SF-NPs) were produced by two high-energy emulsification methods, ultrasonication and high pressure homogenization (HPH), in oil-in-water (o/w) emulsions using as n-dodecane as oil phase. According to optimized results, best formulations were obtained for 10 g/L of SF at 20/80 of o/w ratio at 22 cycles of homogenization by double-stage HPH (APV-2000™). During the NPs production by HPH emulsification process, the secondary SF structure changed from random-coil conformation to a more stable structure, β -sheets. Stabilizers effect was also studied, namely poloxamer 407, transcutol, tween 80 and sodium dodecyl sulfate (SDS), in which the results suggested that combination of transcutol and SDS would effectively stabilize the SF-NPs over time. To predict the sivelestat incorporation, orange IV was used as a model-drug, being this incorporated into SF-NPs at different concentrations. Release studies of orange IV were evaluated in absence and presence of 0.5 U/mL of HNE. The release of orange IV at 100 μM from SF-NPs (concentration considered as optimal) showed to be controlled at some extent, in which the drug transport mechanism showed to be anomalous (Fickian diffusion and polymer degradation/relaxation) and not affected by 0.5 U/mL of HNE enzyme. Finally, the incorporation of 100 μM of sivelestat in SF-NPs performed with a formation and encapsulation efficiency of 99% and 50%, respectively, successfully inhibited the HNE enzyme, enhancing the potential of this drug delivery system for topical antiwrinkling application.

Elastase de Neutrófilos Humana, como resposta inflamatória, possui a capacidade de degradar os componentes da matriz extracelular, nomeadamente colagénio e elastina, estando envolvida na formação de rugas causadas pela radiação ultravioleta. De forma a desenvolver uma emulsão cosmética antirrugas, decidiu-se incorporar um potente inibidor sintético de elastase, sivelestat (IC50 = 44 nM, Ki = 0,2 μM), em nanopartículas biopoliméricas formadas por métodos de emulsificação de elevada energia. Como nanomaterial usou-se a proteína fibroína de seda extraída do bicho-da-seda Bombyx mori, que é um polímero natural biocompatível e biodegradável aprovado pela FDA. As nanopartículas de fibroína de seda foram produzidas por dois métodos de emulsificação, ultrasonicação e homogeneização de elevada pressão, com emulsões óleo-em-água, tendo-se usado n-dodecano como fase oleosa. De acordo com os resultados otimizados, a melhor formulação foi obtida com 10 g/L de fibroína de seda numa razão óleo/água de 20/80 a 22 ciclos de homogeneização, através do método de duplo-sistema de homogeneização de elevada pressão (APV-2000™). Nestas condições, durante a produção de nanopartículas nestas condições, a estrutura secundária aleatória da proteína de fibroína de seda sofreu uma alteração conformacional para uma estrutura mais estável, em folhas βeta. O efeito de estabilizadores na nanoemulsão foi também estudado, nomeadamente poloxamer 407, transcutol, tween 80 e dodecil sulfato de sódio, em que os resultados obtidos sugerem que a combinação de transcutol e dodecil sulfato de sódio estabilizaria eficientemente as nanopartículas de fibroína de seda ao longo do tempo. Para prever a incorporação de sivelestat, o corante orange IV foi utilizado como composto modelo, tendo sido incorporado nas nanopartículas de fibroína de seda a várias concentrações, e tendo-se estudado a sua libertação na ausência e na presença de elastase (0,5 U/mL). A libertação de orange IV das nanopartículas de fibroína de seda, numa concentração de 100 μM (concentração otimizada), exibiu um mecanismo de transporte controlado, tendo este sido definido como anómalo (difusão de Fickian e degradação/relaxamento do polímero) e não mostrou ser influenciada pela elastase (0,5 U/mL). Finalmente, incorporação de 100 μM de sivelestat nas nanopartículas de fibroína de seda que indicou uma eficiência de formação e de encapsulação de 99% e 50%, respetivamente, inibiu a enzima elastase de forma eficaz, evidenciando o potencial deste nanosistema como cosmético antirrugas para aplicação transdérmica.