Avaliação dos mecanismos de interação entre hospedeiro e fago em biofilmes

Abstract

Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii são duas bactérias gram-negativas patogénicas altamente problemáticas em infeções hospitalares muito devido à sua capacidade de aderir a variadíssimas superfícies e formar biofilmes que contribuem bastante para o aumento da resistência aos agentes antimicrobianos, o que consequentemente potencia infeções graves em pacientes. Apesar da terapia fágica ter vindo a ser referida como uma estratégia alternativa no controlo de biofilmes, ainda há poucos estudos sobre a interação de fagos com as respetivas bactérias hospedeiras em biofilme mistos. Este trabalho descreve o efeito de fagos em biofilmes simples de A. baumannii AB1 e biofilmes mistos formados por A. baumannii AB1 e P. aeruginosa PAO1. Para este fim, foram desenvolvidos métodos de diferenciação das duas espécies no biofilme recorrendo à técnica de FISH (do inglês, Fluorescent in situ hibridization). Para uma deteção multiplex de bactérias e fagos foram desenhadas “in silico” sondas com base num novo ácido nucleico LNA (do inglês Locked Nucleic Acid), contudo só a sonda específica para a bactéria P. aeruginosa foi sintetizada e aplicada ao estudo. O método de LNA FISH para a identificação desta bactéria foi otimizado e testes laboratoriais em amostras de subespécies de Pseudomonas confirmaram os valores teóricos previstos de especificidade e sensibilidade. Os ensaios de infeção fágica contra biofilme simples de A. baumannii, mostraram que os fagos são eficientes, mesmo usando uma razão de 1 fago para 1 célula hospedeira. Com efeito, verificou-se uma redução de aproximadamente 2 log de células viáveis em biofilmes de 24 h após 6 h de contacto com o fago. Contudo a eficácia dos fagos mostrou-se significativamente superior contra células do biofilme raspado o que indica que a matriz do biofilme constitui uma barreira para a eficiente atuação do fago. Os biofilmes mistos mostraram uma predominância de P. aeruginosa em relação a A. baumannii, mesmo quando P.aeruginosa é adicionada após colonização inicial por A.baumannii. A aplicação de um cocktail formado por fagos específicos contra estas duas espécies presentes em biofilme misto revelou uma redução de 2 log de P. aeruginosa e de aproximadamente 1,5 log de A. baumannii após 6 h. No entanto, após 24 h de infeção, foi possível observar, em todos os biofilmes estudados, um aumento de células viáveis podendo este facto estar relacionado com a aquisição de resistência das bactérias aos respetivos fagos. A técnica de LNA FISH demostrou ser eficiente na discriminação clara das populações de biofilme misto, sendo um complemento na deteção / compreensão na interação dos fagos com os seus hospedeiros em estruturas complexas como os biofilmes. Em suma, este trabalho demonstrou o valor potencial dos fagos no controlo de biofilmes, tornando-se no entanto necessário progredir na presente investigação, para se definirem as condições ótimas de atuação dos fagos e as razões da diminuição da eficácia dos fagos quando em contacto com o biofilme por períodos superiores a 6 h.

Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii are two pathogenic gram-negative bacteria that are highly prevalent in hospital infections due to their natural ability to adhere to surfaces and form biofilms. Cells in biofilms are more tolerant to antimicrobial agents and this enhances serious infections in patients. Phage therapy has been reported as an alternative strategy for biofilm control but the interaction of phages with the respective bacteria in mixed biofilm in poorly understood. The work described herein focuses on the effect of phages in single species of A. baumannii biofilms and in mixed biofilms formed by A. baumannii AB1 and P. aeruginosa PAO1. To this end, methods were developed for the differentiation of the two species in biofilm using the FISH (Fluorescent in situ hibridization) technique. For multiplex detection of bacteria and phage probes based on a novel nucleic acid LNA (Locked Nucleic Acid) were designed "in-silic", but only the probe specific for the bacteria P. aeruginosa was synthesized and applied to the study. The LNA FISH method was optimized, and laboratory testing on representative strains from the Pseudomonas genus subspecies confirmed the predicted theoretical values of specificity and sensitivity. Phage infection of A. baumannii single biofilms shows that phages were efficient even when a ratio of 1 phage to 1 host cell is used. Indeed, there was a reduction of 2 log in viable cells of 24 h biofilms, after 6 h of contact with the phage. Furthermore, the efficiency of phage was significantly higher against biofilm scraped cells indicating that the biofilm matrix is hindering the efficient performance of the phage. The composition of mixed biofilms revealed a predominance of P. aeruginosa compared to that of A. baumannii... The application of a phage cocktail resulted in a reduction of 2 log of P. aeruginosa and 1,5 log of A. baumannii after 6 h. Nevertheless, after 24 hours of infection it was observed the increase of viable cells in all biofilms studied. This result can be explained by the acquisition of resistance of the bacterial hosts towards the respective phages. The LNA FISH technique demonstrated to be efficient in the clear discrimination of mixed biofilm populations, being a complement the detection / understanding the interaction of phages with their hosts in complex structures such as biofilms. Briefly, this study demonstrated the potential use of phages for biofilm control, however become necessary to progress in this research, to define the optimal conditions of phage infections and the reasons for the decreased effectiveness of phages when in contact with the biofilm for periods longer than 6 h.