Versatile route to approach nanoscale protein multiplexing

Abstract

On the last decade protein arrays have earned a highlight place in drug discovery or to study protein-protein interaction. The miniaturization of such systems and the ability to study interactions with several proteins at the same time has been proven invaluable in these fields. More recently, with the inclusion of protein arrays in microfluidic devices, these platforms have also been used in biosensing or bioanalytics. However, despite the fundamental breakthroughs that have been made in the development of such devices, there still is a need to develop new strategies which allow the reduction of the amount of protein used, the reduction of the area on which the proteins are immobilized and the immobilization of multiple proteins using soft conditions. This thesis reports two different approaches to immobilize proteins: by coordination of polyhistidine-tag to Ni-NTA motifs on the surface of polystyrene microparticles and by directing proteins onto the surface of a conductive polymer, polypirrole, by applying an electric field. H6-EGFP and SNAP-Flag-His10 were expressed in E. coli and purified using immobilized metal affinity chromatography and size exclusion chromatography. The binding of H6-EGFP onto polystyrene microparticles covered with Ni-NTA motifs is analyzed by fluorescence spectroscopy and fluorescence microscopy. It is also shown how immobilization of functionalized particles can be used for the creation of inexpensive protein microarrays. The second approach described shows how the sequential electrogeneration of polypyrrole films can be used to immobilize different proteins on distinct electrodes of a single array. It is also shown how the use of an electric field may enhance the adsorption of the proteins onto the polypyrrole film.

Na última década, arrays de proteínas ganharam um lugar de destaque na descoberta de fármacos ou no estudo de interações proteína-proteína. A miniaturização destes sistemas e a capacidade de estudar interações com várias proteínas ao mesmo tempo provou ser importantíssimo nestas áreas. Mais recentemente, com a aplicação de arrays de proteínas em dispositivos microfluidicos, estas plataformas também foram usadas como biosensores ou em bioanalitica. No entanto, e apesar dos avanços fundamentais no desenvolvimento de tais dispositivos, ainda existe a necessidade de desenvolver novas estratégias que permitam reduzir a quantidade de proteína usada, reduzir a área sobre a qual as proteínas são imobilizadas e a imobilização de várias proteínas usando condições suaves. Esta tese relata duas estratégias de imobilização de proteínas diferentes: por coordenação de sequências de poli-histidina com motivos Ni-NTA na superfície de microparticulas de poliestireno e por direcionamento de proteínas para a superfície de um polímero condutor, polipirrole, por aplicação de um campo eléctrico. H6-EGFP e SNAP-Flag-His10 foram expressas em E. Coli e purificadas por cromatografia de afinidade com metal imobilizado e cromatografia por exclusão de tamanho. A adsorção de H6-EGFP à superfície de micropartículas de poliestireno cobertas com motivos Ni-NTA é analisada por spectroscopia de fluorescência e por microscopia de fluorescência. Também se mostra como a immobilização de partículas funcionalizadas pode ser usada para a creação de microarrays de proteínas economicamente acessiveis. A segunda estratégia descrita mostra a como electrogeração sequencial de filmes de polipirrole pode ser usada para immobilizar diferentes proteínas em eletrodos distintos dum único array. É também mostrado como o uso de um campo eléctrico pode aumentar a adsorção de proteínas à superfície do filme de polipirrole.