Genotoxic, phytotoxic and protective effects of Portuguese propolis

Abstract

Propolis is a mixture produced by bees (Apis mellifera L.) from various plant sources with a diverse chemical composition including many bioactive phenolic compounds and terpenes characteristic of plant secondary metabolism. The bees use propolis mainly as a sealant for cracks in the beehive, but it has been used in human folk medicine for several millennia. A renewed interest in its study emerged in recent years due to the increasing popularity of natural products in foods, beverages and medicines. Propolis extracts have been associated with varied biological activities, like antioxidant, antimicrobial and anti-inflammatory among others, and indicated for the treatment of several pathologies such as cancer or neurodegenerative diseases. Portuguese propolis, usually regarded as a by-product without any value in apiaries, remains insufficiently studied, hence the need for a better characterization of its properties. In this study Portuguese propolis samples from different apiaries and different collection dates were selected and ethanolic and n-hexane extracts were prepared and tested using a yeast (Saccharomyces cerevisiae) and in vitro flax (Linum usitatissimum) cultures as models. Viability assays with yeast cells and plant growth analysis were performed to assess extracts toxicity. The yeast model was used to investigate mechanisms of cytotoxicity by the mitochondrial membrane potential-targeting fluorochrome rhodamine 123 approach and to evaluate genotoxicity by the comet assay. The in vitro plant model was used to evaluate extracts effects at the multicellular developmental level as well as in the photosynthetic function by pulse amplitude modulated fluorometry. Both photoinhibitiory and photoprotective potential against oxidative damage of the extracts were investigated using plants grown under high light intensities. Extracts antioxidant properties were also studied in yeast by flow cytometry using the redox-sensitive fluorochrome dichlorofluorescein diacetate. Our results suggest that ethanolic extracts from Pereiro and Póvoa do Varzim apiaries are among the most toxic for both yeast and plants. They decrease yeast viability and mitochondrial membrane potential and dramatically affect early plant development inhibiting particularly root growth, photosynthetic efficiency and increasing nonphotochemical quenching in a dose-dependent manner. Significant genotoxicity was found only in ethanolic extracts from Pereiro collected in 2010, also one of the most toxic in both models tested. However, some ethanolic extracts were also able to revert oxidative-induced damage. They reduced intracellular oxidation induced by hydrogen peroxide in yeast, and greatly recovered the total chlorophyll content reduced by high-light-induced photooxidative stress. Here, also n-hexane extracts were effective. Globally our results are in line with the antioxidant properties revealed by propolis worldwide but also underline the strong toxicity in different cellular models suggesting that eukaryotic universal mechanisms/structures may be the most affected, possibly mediated by the production of reactive oxygen species. These effects are promising for different applications namely in food industry as preservative, agro-chemical as bioherbicide or pesticide and in pharmaceutical industry as a source of new drugs.

O própolis é uma mistura produzida pelas abelhas (Apis mellifera L.) a partir de várias plantas, possuindo uma constituição química diversa que inclui numerosos compostos fenólicos e terpenos bioativos característicos do metabolismo secundário vegetal. O própolis é usado pelas abelhas como selante para fendas na colmeia, mas tem sido também usado na medicina humana há vários milénios. Um interesse renovado no seu estudo surgiu, em tempos recentes, devido à popularidade dos produtos naturais em alimentos, bebidas e medicamentos. Os extratos de própolis estão associados a atividades biológicas variadas: antioxidante, antimicrobiana, antiinflamatória e indicados para aplicação na terapia de várias patologias tais como cancro ou doenças neurodegenerativas. O própolis português, frequentemente considerado um sub-produto sem valor na apicultura nacional, permaneceu até aos nossos dias insuficientemente estudado, daí a necessidade de realizar uma melhor caracterização das suas atividades. Para estudar os extratos portugueses de própolis foram escolhidas várias amostras de vários apiários e períodos de coleta, que foram testadas numa levedura (Saccharomyces cerevisiae) e na planta do linho in vitro (Linum usitatissimum), utilizados como modelos biológicos. Ensaios de viabilidade com levedura e análise do crescimento do linho foram realizados para avaliar a toxicidade. O modelo levedura foi usado para investigar mecanismos de citoxicidade com o fluorocromo rodamina 123, que tem como alvo a membrana mitocondrial interna, e a genotoxicidade com o ensaio cometa. O modelo vegetal in vitro foi usado para avaliar os efeitos dos extratos ao nível do desenvolvimento multicelular, bem como na função fotossintética por fluorometria. Tanto o potencial fotoinibitório como fotoprotetor dos extratos contra danos oxidativos foram investigados com plantas expostas a intensidades luminosas elevadas. Novamente em levedura, realizou-se citometria de fluxo para aferir a atividade antioxidante com o fluorocromo fluoresceína diacetato e os efeitos ao nível mitocondrial com rodamina 123. Os resultados obtidos sugerem que os extratos etanólicos de Pereiro e Póvoa são os mais tóxicos quer em levedura quer em linho. Diminuem a viabilidade celular e potencial de membrana mitocondrial em levedura, e afetam dramaticamente o desenvolvimento das plantas, inibindo o crescimento radicular, eficiência fotossintética e aumentando o quenching não fotoquímico. A genotoxicidade do extrato etanólico de Pereiro 2010 foi confirmada por ensaio cometa. Contudo, alguns extratos etanólicos também reverteram danos oxidativos. Reduziram a oxidação intracelular em levedura e recuperaram o teor de clorofilas reduzido por stresse fotooxidativo. Também, aqui os extratos de n-hexano foram eficazes. Globalmente, os resultados estão em linha com as propriedades antioxidantes reportadas para o própolis, mas também sublinham a forte toxicidade em diferentes modelos, o que sugere que mecanismos universais dos eucariontes possam ser o alvo, possivelmente através da produção de espécies reativas de oxigénio. Estes efeitos são promissores para diferentes aplicações nomeadamente na indústria alimentar como conservante, agroquímica como bioherbicida ou pesticida, ou farmacêutica como fonte de novas substâncias.