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TítuloElucidation of the molecular mechanisms underlying the cytotoxic effect of recombinant frutalin in human tumor cells
AutorMendonça, Sofia Emanuela Soares
OrientadorDomingues, Lucília
Saraiva, Lucília
Data2013
ResumoFrutalin is the α-D-galactose-binding jacalin-related lectin isolated from breadfruit seeds (Artocarpus incisa). Frutalin has been previously produced in Pichia pastoris and in Escherichia coli in order to overcome the limitations associated with the extraction from its natural source. A previous study also showed that recombinant frutalin expressed in Pichia pastoris and purified by size-exclusion chromatography (SEC) induces apoptosis in HeLa tumoral cells. Nevertheless, the molecular mechanism of apoptosis induction triggered by frutalin has not been studied. Therefore, with the present work it was intended to elucidate the molecular mechanism involved in apoptosis induction by the recombinant frutalin expressed in Pichia pastoris and purified by SEC. To achieve such a goal, the modulatory effect of frutalin on main regulatory proteins of apoptosis, such as the executioner members of the caspase family (caspases-3, -6 and -7) and the p53 family members was studied using yeast-based assays. The results obtained showed that the p53 family proteins (p53, p63, p73 and DN) are not direct targets of frutalin. Moreover, using human tumor cells with (HCT116 p53+/+) and without (HCT116 p53-/-) wild-type p53, we confirmed that frutalin induces apoptosis by a p53- independent pathway. Concerning the procaspases-3, -6 and -7, the results obtained suggest that frutalin induces apoptosis by a caspase-dependent pathway. In addition, different molecules of frutalin expressed in a different expression system (E. coli) and/or purified by a different methodology (hydrophobic interaction chromatography; HIC) were tested for its anti-proliferative activity in order to see if one could improve the production and purification process. Thus, the activity of frutalin produced in the bacteria Escherichia coli and in the yeast Pichia pastoris purified by HIC was also evaluated regarding its effect on the proliferation of HCT116 p53+/+ tumor cells. The frutalin expressed in E. coli did not inhibit cell proliferation. Additionally, frutalin expressed in P. pastoris and purified by HIC, resulted in two different samples suggesting that one is partially glycosylated and the other is non-glycosylated. The sample partially glycosylated also showed an inhibitory of proliferation of HCT116 p53+/+ tumor cells. However, this activity was less potent than the one obtained with frutalin from P. pastoris and purified by SEC. The sample non-glycosylated had no anti-proliferative effects. The same result was obtained for frutalin expressed in E. coli, suggesting that glycosylation affects the biological activity of frutalin. In conclusion, trials to obtain the recombinant frutalin in a more straightforward production/purification process were ineffective as alternative systems, because the anti-proliferative activity of frutalin was compromised. Frutalin produced from Pichia pastoris and purified by SEC has, nevertheless, a potent anti-proliferative effect on HCT116 tumor cells and induces apoptosis through a caspase-dependent pathway.
Frutalina é uma lectina α-D-galactose-ligante jacalina-relacionada isolada nas sementes da planta fruta-pão (Artocarpus incisa). A frutalina foi produzida, anteriormente, em Pichia pastoris e em Escherichia coli de modo a superar limitações associadas à sua extração da fonte natural. Um estudo anterior mostrou que a frutalina expressa em Pichia pastoris e purificada por cromatografia de exclusão de peso molecular (SEC) induz a apoptose em células tumorais humanas. Todavia, o mecanismo molecular de indução da apoptose pela frutalina ainda não foi estudado. Assim, com o presente trabalho pretende-se elucidar o mecanismo molecular envolvido na indução da apoptose pela frutalina expressa em P. pastoris e purificada por SEC. Para atingir este objetivo foi estudado, através da utilização de um modelo celular de levedura, o efeito modulador da frutalina nas principais proteínas reguladoras da apoptose como membros da família de caspases executoras (caspases-3, -6 and -7) e membros da família da proteína p53 (p53, p63, p73 e DN). Os resultados obtidos mostraram que os membros da família da proteína p53 não são alvos diretos da frutalina. Além disso confirmou-se, através da utilização de células tumorais humanas com (HCT116 p53+/+) e sem (HCT116 p53-/-) a forma nativa da p53, que a frutalina induz a apoptose por uma via independente da p53. Relativamente aos resultados obtidos para as procaspases-3, -6 e -7, estes sugerem que a frutalina induz a apoptose por uma via dependente das caspases. Foi testada, também, a atividade anti-proliferativa de diferentes moléculas de frutalina expressa num sistema de expressão diferente (E. coli) e/ou purificada por uma metodologia diferente (cromatografia de interação hidrofóbica; HIC), a fim de se verificar se poderiam melhorar o processo de produção e purificação. Assim, foi avaliado o efeito da frutalina produzida na bactéria Escherichia coli e na levedura Pichia pastoris purificada por HIC na proliferação de células tumorais HCT116 p53+/+. A frutalina expressa em E. coli não inibiu a proliferação celular. Adicionalmente, a frutalina expressa em Pichia pastoris e purificada por HIC resultou em duas amostras diferentes sugerindo que uma é parcialmente glicosilada e outra não é glicosilada. A amostra parcialmente glicosilada mostrou ter efeito na inibição da proliferação das células tumorais HCT116 p53+/+. No entanto, esta atividade é menos potente do que a obtida com a frutalina expressa em P. pastoris e purificada por SEC. A amostra não glicosilada não teve efeito na inibição da proliferação celular. O mesmo resultado foi obtido para a frutalina expressa em E. coli sugerindo que a glicosilação afeta a atividade biológica da frutalina. Em conclusão, os ensaios para obter a frutalina recombinante através de um processo de produção/purificação mais simples foram ineficazes como sistemas alternativos, uma vez que comprometeram a atividade anti-proliferativa da frutalina. A frutalina produzida por Pichia pastoris e purificada por cromatografia de exclusão de peso molecular tem, no entanto, um potente efeito antiproliferativo nas células tumorais HCT116 e induz a apoptose por uma via dependente das caspases.
TipomasterThesis
DescriçãoDissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)
URIhttp://hdl.handle.net/1822/27688
AcessoopenAccess
Aparece nas coleções:BUM - Dissertações de Mestrado Integrado
CEB - Dissertações de Mestrado / MSc Dissertations

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