Development of a voltammetric aptasensor for the detection of proteins with biomedical relevance

Abstract

Translating biomedical knowledge of biomarkers into clinically relevant devices that could be used as diagnostic or monitoring tools for disease management using effective analytical techniques is extremely important and still remains a challenge. However, the existing analytical methods for real-time protein detection in homogeneous solutions are limited. In this research, molecular aptamers were combined with fluorescence techniques and electrochemical sensors to provide an easy and efficient method to detect proteins. In a first step, two types of high-affinity thrombin-binding aptamers (TBA1 and TBA2) and OPN-R3, an aptamer that has been reported to bind specifically to human osteopontin, were labeled with 6-FAM and used as molecular recognition probes to conduct ELISA experiments with human thrombin, human osteopontin and interferences such as bovine osteopontin and bovine serum albumin. Through nonlinear fitting it was found a dissociation constant value of 1.820 nM and 0.867 nM for TBA1 and TBA2, respectively, and 5.65 nM for OPN-R3. This constant, Kd is commonly used to describe the affinity between a ligand and a protein i.e. how tightly a ligand binds to a particular protein. An Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) was also conducted to validate the formation of the aptamer:protein complexes, however the results obtained were inconclusive, possibly due to the low protein concentrations used. The ultimate goal of this work was to develop a voltammetric aptasensor for the detection of thrombin, using the aptamer as the detection probe and [Fe(CN)6]4-/3 as the electrochemical active redox solution. Appropriate aptamer sequences (TBA1 and TBA2) were designed to enable binding to thrombin, and also to include a biotin molecule in the 5’-end for the immobilization step. The aptamers were immobilized through the avidin-biotin methodology on screen-printed electrodes adequate for electrochemical detection. Thrombin detection was studied using cyclic voltammetry. The aptasensor presented a linear response for thrombin concentrations in the range between 0.5 nM and 50 nM, and a detection limit of 0.025 nM. Furthermore, this aptasensor was found to be specific for thrombin. The results gathered in this thesis are promising, suggesting that aptasensors constitute an alternative approach for the detection of proteins with biomedical relevance.

O desenvolvimento de dispositivos que constituam ferramentas de diagnóstico e monitorização de doenças, fazendo recurso ao conhecimento existente sobre biomarcadores e usando técnicas analíticas eficazes, é actualmente uma área de grande interesse e relevância. No entanto, as técnicas analíticas disponíveis para a deteção de proteínas em tempo real e em soluções homogéneas são ainda limitadas. Neste trabalho de investigação, os aptámeros moleculares foram combinados com técnicas de fluorescência e sensores eletroquímicos para desenvolver uma abordagem simples e eficiente para a deteção de proteínas. Numa primeira etapa, dois tipos de aptámeros de elevada afinidade de ligação à trombina (TBA1 e TBA2) e o aptámero OPN-R3, que foi reportado por se ligar especificamente a osteopontina humana, foram marcados com 6-FAM e usados como sondas de reconhecimento molecular para conduzir ensaios ELISA com trombina e osteopontina humana e interferentes como osteopontina bovina e albumina de soro bovina. Através do ajuste não linear dos dados foi possível determinar um valor para a constante de dissociação de 1.820 nM e 0.867 nM para TBA1 e TBA2, respectivamente, e 5.65 nM para o OPN-R3. Esta constante, Kd é usada para descrever a afinidade entre um aptámero e uma proteína, ou seja, saber quão forte é a ligação entre o aptámero e a respectiva proteína. Adicionalmente, foram realizados ensaios de mobilidade electroforética, a fim de validar a formação do complexo aptámero:proteína, no entanto os resultados obtidos foram inconclusivos, possivelmente devido às baixas concentrações de proteína usadas. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um aptasensor voltamétrico para a deteção de trombina, usando o aptámero como sonda de detecção e [Fe(CN)6]4-/3 como solução redox electroquímica. Foram desenhadas sequências de aptámeros marcados com uma molécula de biotina na sua extremidade 5’ para auxiliar o passo de imobilização. Estas sequências: TBA1 e TBA2 ligam especificamente à trombina. Os aptámeros foram imobilizados usando a metodologia da avidina-biotina em eléctrodos desenhados especificamente para a deteção electroquímica. A detecção da trombina foi estudada por voltametria cíclica. O aptasensor apresenta uma resposta linear para concentrações de trombina na gama entre 0.5 nM e 50 nM, e um limite de detecção de 0.025 nM. Adicionalmente, verificou-se que o aptasensor é específico para a trombina. Os resultados desta tese são bastante promissores, sugerindo que os aptasensores podem constituir uma abordagem alternativa para a deteção de proteínas com relevância biomédica.