Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/2738

TitleContributions to the study of the Pinus Pinaster-Botrytis cinerea interaction
Author(s)Azevedo, Herlânder
Advisor(s)Tavares, R. M.
Issue date2005
Abstract(s)Maritime pine (Pinus pinaster Ait.) is a two-needle pine widely distributed throughout SW Europe. P. pinaster is a pioneer species and its adaptability and phenotypical characteristics make it an economically important forest species, being considered one of the three most important pines in Europe. Botrytis cinerea is a necrotrophic fungus, requiring the killing of plant cells for disease progression. B. cinerea is the causal agent of grey mould disease and a broad range pathogen, capable of infecting over two hundred hosts. Adult populations of maritime pine are resistant to B. cinerea infection, but seedling nurseries and young plantations are often attacked, resulting in severe economical losses. In the present work, plant defence mechanisms were analysed for their involvement in the response of Pinus pinaster to the non-host necrotrophic pathogen Botrytis cinerea. To establish an elicitation model for the study of P. pinaster-B. cinerea interactions, a maritime pine heterotrophic cell suspension culture was initiated from root-derived calli in modified MS medium. Suspension cultures were characterized for biomass production, pH, cell viability and the consumption of sugars, phosphate, nitrate, and ammonium. The results indicate that nutrient consumption exhibited a biphasic profile during near exponential growth. Additionally, growth arrest was accompanied by a pronounced death curve. Sugar-starved P. pinaster suspended cells exhibited increased acid phosphase activity and DNA degradation, as shown by TUNEL, suggesting than PCD by autophagy accounts for pine cell death in sugardepleted medium. When elicited by B. cinerea spores, P. pinaster suspended cells were able to produce two ROS bursts, contrarily to what was observed when elicitation was performed by B. cinerea and L. seditiosum mycelia extracts. The first burst of ROS production was shown to be dependent on calcium influx, but independent on the activation of MAPK and NADPH oxidase. However, MAPK, NADPH oxidase, as well calcium, seem to be involved in the transduction pathway responsible for triggering the second ROS burst. The ROS-scavenging capacity of P. pinaster cells during the time course of elicitation with B. cinerea was evaluated by determining the activity of the antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase by gel activity assays, and by analyzing transcript levels of genes encoding ROS-scavenging enzymes (FeSod, chlCu,Zn-Sod and csApx). For full-length cDNAs isolation, a P. pinaster cDNA library was constructed. Taken together, the results suggested that elicitation by B. cinerea induces a decrease in the enzymatic ROS-scavenging capacity of pine cells, probably as a strategy for favouring ROS bursts. Analysis on the role of phenylpropanoid metabolism in the P. pinaster-B. cinerea interaction was also performed. Results showed that in elicited pine cells there is a decrease in total phenolics and lignin. Full-length cDNAs (Pal1, Pal2, Chs1, Chs2, Ch3) encoding PAL and CHS were identified. Pal1 is down-regulated, while Chs1 and Chs2 were undetected even in non-elicted cells. Is is possible to suggest that elicited maritime pine cells are limited in their capability to promote phytoalexin biosynthesis and cell wall reinforcement. A major role has been reported for salicylic acid in modulating plant response against abiotic and biotic stresses. Accordingly, the effect of salicylic acid on the upregulation of the P. pinaster chloroplastic Cu,Zn-Sod in P. pinaster needles was observed, suggesting a role of this SOD isoform in salicylic acid-mediated H2O2 increase in chloroplasts. Effect of Botrytis cinerea elicitation on glucose transport in Pinus pinaster suspended cultured cells was also evaluated. P. pinaster suspended cells were able to transport glucose by a monosaccharide/H+ symporter, only when sugar was depleted from the culture medium. B. cinerea challenging was also able to increase sugar carrier activity, suggesting that elicited pine cells are able to increase sugar mobilization. NADPH oxidase and calcium, but not MAPK seem to play a role in the transduction of the B. cinerea elicitation signal responsible for the induction of the sugar carrier. However, activation of MAPK seems to be required for carrier derepression, induced by low sugar levels.
O pinheiro bravo (Pinus pinaster Ait.) é um espécie que se encontra amplamente distribuida no Sudoeste Europeu. P. pinaster é uma espécie pioneira, e a sua adaptabilidade e características fenotípicas tornaram-na numa espécie florestal de elevado interesse económico. Botrytis cinerea é um fungo necrotrófico, induzindo a morte das células do hospedeiro para a progressão da infecção. B. cinerea é o agente da doença do bolor cinzento e um fungo patogénico de amplo espectro, sendo capaz de infectar mais de duzentas espécies vegetais. Populações adultas de pinheiro bravo exibem resistência a B. cinerea, enquanto que plântulas em viveiro e plantações jovens são frequentemente atacadas, resultando em acentuadas perdas económicas. No presente trabalho, vários mecanismos de defesa das plantas from analizados no seu envolvimento na resposta de Pinus pinaster ao patogénio B. cinerea. De modo a estabelecer um modelo de elicição para o estudo das interacção P. pinaster-B. cinerea, culturas heterotróficas de células em supensão de pinheiro bravo foram iniciadas a partir de calli de segmentos de raíz, em meio MS modificado. As culturas em suspensão foram caracterizadas no que refere à biomassa, pH, viabilidade celular, e consumo de açúcares, fosfato, nitrato e amónio. Os resultados evidenciaram que o consumo de nutrientes exibe um perfil bifásico no decurso do crescimento quase exponencial. Adicionalmente, a paragem do crescimento das células foi acompanhada por uma curva de morte. Culturas em suspensões de P. pinaster depletadas em açúcar exibiram elevada actividade da enzima fosfatase ácida, e evidenciaram degradação do DNA detectada por TUNEL, o que sugere que um mecanismo de morte celular programada por autofagia possa ser responsável pela morte em células de pinheiro privadas de açúcar. Quando eliciadas com esporos de B. cinerea, células em suspensão de P. pinaster foram capazes de exibir dois picos de produção ROS, contrariamente ao observado quando a eliciação foi realizada com extractos de micélio de B. cinerea e L. seditiosum. O primeiro pico foi dependente do influxo de cálcio mas independente da activação de MAPK ou de NADPH oxidases. Contrariamente, MAPK, NADPH oxidase e cálcio parecem estar envolvidos na via de transdução do sinal responsável pelo despoletar do segundo pico de ROS. A capacidade anti-oxidante de P. pinaster no decurso da eliciação com B. cinerea foi avaliada pela determinação da actividade das enzimas antioxidantes catalase e superóxido dismutase, e pela análise da transcrição de genes codificantes para enzimas antioxidantes (FeSod, chlCu,Zn-Sod e csApx). A região codificante destes genes foi identificada através da construção de uma biblioteca de cDNA de P. pinaster e rastreio de forma a seleccionar os respectivos clones homólogos de cDNA. Os resultados sugerem que eliciação por B. cinerea induz a diminuição da capacidade anti-oxidante das células de P. pinaster, o que reflecte uma possível estratégia de P. pinaster de favorecer a produção de picos de ROS. Foi analisado o possível envolvimento do metabolismo dos fenilpropanóides na interacção P. pinaster-B. cinerea. Foi observado que células de pinheiro eliciadas exibiam menor quantidade de compostos fenólicos solúveis e de lenhina. Adicionalmente, foram identificados clones de cDNA homólogos a genes que codificam as enzimas PAL e CHS (Pal1, Pal2, Chs1, Chs2, Ch3), por rastreio da biblioteca de cDNA. Estudos de expressão dos genes mostraram que a expressão do gene Pal 1 era reprimida, não tendo sido detectada a presença de transcritos dos genes Chs1 e Chs2 em células eliciadas de pinheiro bravo. Estes resultados permitem sugerir que células eliciadas de pinheiro estejam condicionadas quanto à capacidade de promover a síntese de fitoalexinas e o reforço da parede celular. Tem vindo a ser assinado que o ácido salicílico pode desempenhar uma função importante ao nível da modulação da resposta das plantas ao stresse biótico e abiótico. Em plantulas de pinheiro bravo tratadas com ácido salicílico, este parece ser capaz de induzir a expressão do gene Cu,Zn-Sod, que codica a forma cloroplastidial da Cu,Zn-SOD, sugerindo que uma função para esta isoforma possa ser a de contribuir para o aumento de H2O2 nos cloroplastos, dependente de SA. O efeito da eliciação de B. cinerea no transporte de glucose em células em suspensão de Pinus pinaster foi igualmente avaliado. Células em suspensão de Pinus pinaster são capazes de transportar glucose através um simportador de H+-monosacárido, na ausência de açúcar no meio. Eliciação com esporos de B. cinérea também promoveu a indução da actividade do transportador de monosacáridos na ausência de repressão pela glucose, sugerindo que células eliciadas de pinheiro bravo exibem maior capacidade de mobilização de açúcares. Adicionalmente foi observado que a desrepressão do transportador de monosacáridos exercida por condições de depleção parece ser mediada pela NADPH oxidase e cálcio, mas não por MAPK. Todavia as MAPK, conjuntamente com a NADPH oxidase e o cálcio parecem participar na transdução do sinal de eliciação de B. cinerea, responsável pela indução do transportador de açúcar.
TypeDoctoral thesis
DescriptionTese de doutoramento em Ciências - Biologia
URIhttp://hdl.handle.net/1822/2738
AccessOpen access
Appears in Collections:BUM - Teses de Doutoramento
DBio - Teses de Doutoramento/Phd Theses

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