Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/27319

TitleUnderstanding the biotechnological potential of Ashbya gossypii
Author(s)Aguiar, Tatiana Quinta
Advisor(s)Domingues, Lucília
Penttilä, Merja
Issue date6-Sep-2013
Abstract(s)Ashbya gossypii (syn. Eremothecium gossypii) is a filamentous Saccharomycete which has long been known in the scientific and industrial communities, first as a cotton pathogen and subsequently as a riboflavin overproducer. This fungus has the smallest free living eukaryotic genome known, which shares a high degree of gene homology and gene order conservation with that of Saccharomyces cerevisiae. It has haploid nuclei and is prone to genetic manipulation, allowing the use of simple PCR-based gene targeting strategies and free propagation of plasmids containing replicons from S. cerevisiae. Moreover, it grows well in a variety of defined, complex and waste-based media, and has a long history of safe use in the industrial production of riboflavin (vitamin B2). These unique features led to expanded interest in A. gossypii as a “minimal” host for the production of, yet unexploited, valuable compounds other than riboflavin, namely heterologous proteins. However, although two heterologous proteins have already been successfully secreted by A. gossypii, little is still known about the protein secretion ability of this fungus. To further understand the biotechnological potential of A. gossypii as a cell factory organism, this thesis primarily focused on the characterization of the A. gossypii protein secretory pathway at the genomic, transcriptomic and proteomic levels. Based on experimental observations and on the data from the genomic and transcriptomic analyses, a hydrolytic enzyme, invertase, was deduced to be natively secreted by A. gossypii and molecularly characterized. To further address A. gossypii as a heterologous protein producer, the β-galactosidase from Aspergillus niger was expressed in this fungus under the regulation of different native and heterologous promoters. In addition, a new molecular tool for use in A. gossypii was developed to generate mutant strains free of exogenous selection markers, allowing the creation of improved A. gossypii strains suitable for industrial applications. The results presented in this thesis demonstrate that the amount and variety of proteins natively secreted by A. gossypii to the culture medium is rather low, being more similar to that of yeast than to that of other filamentous fungi. Similarly, the N-glycosylation patterns produced by A. gossypii are generally more similar to those produced by yeast than to those produced by other filamentous fungi. However, extensive hyperglycosylation only occurs in certain culture conditions. Like other filamentous fungi, A. gossypii also seems to be able to trim its N-glycans. A conventional unfolded protein response (UPR) was not activate in A. gossypii in response to heterologous protein secretion nor to dithiothreitol (DTT)-induced secretion stress, as generally observed in other fungi. However, the transcriptional responses of A. gossypii to DTT-induced stress indicate that alternative mechanisms exist in this fungus to cope with protein secretion stress. The A. gossypii invertase was demonstrated to be encoded by the AFR529W (AgSUC2) gene, which is functionally complemented by the S. cerevisiae SUC2 (ScSUC2) gene. The signal sequences of both AgSuc2p and ScSuc2p were able to direct the secretion of invertase into the culture medium in A. gossypii. Similarly to the invertases of other fungi, the expression of the A. gossypii invertase is regulated by the sugars present in the medium. These results expanded our knowledge about the A. gossypii native secretion capacities, being invertase the second hydrolytic enzyme natively secreted by this fungus to be experimental characterized. The β-galactosidase from A. niger was successfully expressed in A. gossypii under the regulation of different promoters. The native TEF promoter revealed to be the best promoter for overexpressing heterologous β-galactosidase in A. gossypii, inducing 2-fold higher secreted activity than the A. gossypii GPD promoter and 7-fold higher than the S. cerevisiae PGK1 and ADH1 promoters. The levels of active β-galactosidase secreted by a S. cerevisiae laboratorial strain transformed with the same plasmids were up to 37 times lower than those obtained in A. gossypii. The secretion of active β-galactosidase by A. gossypii was approximately 1.5-fold higher in glycerol- than in glucose-containing medium. These results highlight the potential of A. gossypii as a heterologous protein producer and open new opportunities to further optimize its secretion capacities using this enzyme as a model. As its activity is easy to detect, the screening for improved secretion will be facilitated. The Cre-loxP recombination system, which has been widely used in other organisms, was successfully adapted for use in A. gossypii, allowing the removal and reuse of selection marker genes in targeted engineering of this fungus. The set of disruption cassettes and plasmids constructed greatly expand the possibilities for genetically engineer A. gossypii, being these suitable for use in both laboratorial and industrial strains, as they do not required any predetermined genetic background. In the future, targeted improvement of A. gossypii strains for industrial applications will benefit from this molecular tool.
O Ashbya gossypii (sin. Eremothecium gossypii) é um Saccharomycete filamentoso há muito conhecido nas comunidades científica e industrial, primeiro como patogénio do algodão e subsequentemente como super-produtor de riboflavina. Este fungo tem o mais pequeno genoma eucariótico não parasitário conhecido, o qual partilha um elevado grau de homologia e conservação de ordem génica com o genoma da Saccharomyces cerevisiae. Ele tem núcleos haplóides e é de fácil manipulação genética, permitindo o uso de estratégias de manipulação genética direcionada simples e a livre propagação de plasmídeos contendo sequências de replicação de S. cerevisiae. Além do mais, cresce bem numa variedade de meios definidos, complexos e baseados em resíduos, e tem um longo historial de utilização segura na produção industrial de riboflavina (vitamina B2). Estas características únicas levaram a um interesse alargado em A. gossypii como hospedeiro “mínimo” para a produção de outros compostos de interesse, ainda inexplorados, para além da riboflavina, nomeadamente proteínas heterólogas. No entanto, apesar de duas proteínas heterólogas já terem sido secretadas por A. gossypii com sucesso, pouco ainda se conhece acerca da capacidade de secreção de proteínas deste fungo. Para melhor compreender o potencial biotecnológico de A. gossypii como fábrica celular, esta tese focou-se primariamente na caracterização da via de secreção de proteínas do A. gossypii aos níveis genómico, transcriptómico e proteómico. Com base em observações experimentais e nos dados das análises genómicas e transcriptómicas, uma enzima hidrolítica, invertase, foi prevista ser nativamente secretada por A. gossypii e molecularmente caracterizada. Para melhor avaliar o A. gossypii como produtor de proteínas heterólogas, a β-galactosidase de Aspergillus niger foi expressa neste fungo sob a regulação de diferentes promotores nativos e heterólogos. Adicionalmente, uma nova ferramenta molecular para uso em A. gossypii foi desenvolvida para gerar estirpes mutantes livres de marcadores de selecção exógenos, permitindo a criação de estirpes de A. gossypii melhoradas para aplicações industriais. Os resultados apresentados nesta tese demonstram que a quantidade e variedade de proteínas nativamente secretadas por A. gossypii para o meio de cultura é relativamente baixa, sendo mais comparável à das leveduras do que à de outros fungos filamentosos. De modo semelhante, os padrões de N-glicosilação produzidos por A. gossypii são genericamente mais semelhantes aos produzidos pelas leveduras do que aos produzidos por outros fungos filamentosos. No entanto, hiperglicosilação extensa só ocorre em determinadas condições de cultura. Tal como outros fungos filamentosos, o A. gossypii parece ter também a capacidade de produzir N-glicanos truncados. Uma unfolded protein response (UPR) convencional não foi ativada em A. gossypii em resposta à secreção de proteínas heterólogas nem ao stress de secreção induzido por ditiotreitol (DTT), como geralmente observado noutros fungos. No entanto, as respostas transcricionais do A. gossypii ao stress induzido por DTT indicam que existem mecanismos alternativos neste fungo para lidar com o stress de secreção proteica. A invertase de A. gossypii foi demonstrada ser codificada pelo gene AFR529W (AgSUC2), que é funcionalmente complementado pelo gene SUC2 de S. cerevisiae (ScSUC2). As sequências sinal da AgSuc2p e ScSuc2p conseguiram direcionar em A. gossypii a secreção de invertase para o meio de cultura. Similarmente às invertases de outros fungos, a expressão da invertase de A. gossypii é regulada pelos açúcares presentes no meio. Estes resultados expandiram o nosso conhecimento acerca das capacidades de secreção nativas do A. gossypii, uma vez que a invertase é apenas a segunda enzima hidrolítica nativamente secretada por este fungo a ser experimentalmente caracterizada. A β-galactosidase de A. niger foi espressa com sucesso em A. gossypii sob a regulação e diferentes promotores. O promoter nativo TEF revelou-se o melhor promotor para sobre-expressar β-galactosidase heteróloga em A. gossypii, induzindo 2 vezes mais atividade secretada do que o promotor GPD de A. gossypii e 7 vezes mais do que os promotores PGK1 e ADH1 de S. cerevisiae. Os níveis de β-galactosidase ativa secretada por uma estirpe laboratorial de S. cerevisiae transformada com os mesmos plasmídeos foram até 37 vezes mais baixos do que os obtidos em A. gossypii. A secreção de β-galactosidase ativa por A. gossypii foi cerca de 1.5 vezes mais alta em meio contendo glicerol em vez de glucose. Estes resultados evidenciam o potencial do A. gossypii como produtor de proteínas heterólogas e abrem novas oportunidades para optimizar as suas capacidades de secreção usando esta enzima como modelo. Como ela é de fácil deteção, o rastreio de melhorias na secreção será facilitado. O sistema de recombinação Cre-loxP, que tem sido amplamente usado em diferentes organismos, foi adaptado com sucesso para utilização em A. gossypii, permitindo a remoção e reuso de marcadores de selecção em engenharia genética direcionada neste fungo. O conjunto de cassetes de deleção e plasmídeos construídos expandem as possibilidades para manipular geneticamente o A. gossypii, sendo adequados quer para uso em estirpes laboratoriais, quer em estirpes industriais, pois não requerem a existência de nenhum background genético predeterminado. No futuro, o melhoramento direcionado de estirpes de A. gossypii para aplicações industriais irá beneficiar desta ferramenta molecular.
TypeDoctoral thesis
DescriptionTese de doutoramento em Bioengenharia
URIhttp://hdl.handle.net/1822/27319
AccessOpen access
Appears in Collections:BUM - Teses de Doutoramento
CEB - Teses de Doutoramento / PhD Theses

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