Translating biology into clinic: new insights on prognostic and predictive biomarkers for urothelial bladder carcinoma

Abstract

Urothelial bladder carcinoma (UBC) represents a significant health problem, as a consequence of its heterogeneous natural history and clinical behavior. Most morbidity and mortality associated with UBC is caused by the muscle-invasive (MI) form of the disease, which represents about 20-30% of all newly diagnosed cases. Moreover, an important proportion of high risk non-muscle invasive (NMI) tumours relapse after transurethral resection and progress to MI disease. Despite radical cystectomy, half of the patients with MI tumours develop metastases. Although perioperative and palliative systemic chemotherapy is recommended for locally-advanced or metastatic UBC, survival benefits are impaired in a significant proportion of patients due to inherent or acquired chemoresistance. Currently, prognostication of patients with MI-UBC is severely hampered by the insufficiency of standard clinicopathological risk factors in accurately predicting individual treatment outcomes. This major drawback can potentially be overcome if biomarkers of tumour aggressiveness and response to chemotherapy are routinely evaluated and included in the pathology reports. Current research efforts are directed into the elaboration of nomograms that can combine well-established clinicopathological parameters with novel putative biomarkers. In this line of investigation, we aimed to characterize a phenotype of bladder cancer aggressiveness in a human series of UBC by studying the clinical and prognostic significance of a panel of distinct biomarkers that, although poorly explored in UBC setting, were described as being involved in tumour angiogenesis and lymphangiogenesis, invasion and metastasis, energy metabolism reprogramming and tumour microenvironment. Moreover, we intended to validate potential therapeutic targets in in vitro assays. Angiogenesis, lymphangiogenesis and lymphovascular invasion (LI) occurrence was assessed with the use of immunohistochemical markers, namely the blood endothelial cell marker CD31, the lymphatic endothelial cell marker D2-40, the lymphangiogenic vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and its receptor VEGFR-3. The specific staining of blood and lymphatic endothelium significantly contributed to an accurate evaluation of LI occurrence, and to a specific distinction between blood vessel invasion (BVI) and lymphatic vessel invasion (LVI). A correlation among high blood vessel density (BVD), high lymphatic vessel density (LVD), tumour progression and LI occurrence was found. BVI by malignant emboli assessed by CD31 staining, and LVI by isolated malignant cells assessed by D2-40 staining, significantly impaired overall survival, and BVI was identified as an independent prognostic factor. When included in a model of bladder cancer aggressiveness combining classical clinicopathological parameters with biomarkers, BVI and LVI contributed to separate between low and high aggressiveness groups. VEGF-C overexpression was correlated with an aggressive phenotype characterized by increased tumour stage, loss of differentiation, high BVD and LVD counts, and characterized by increased tumour stage, loss of differentiation, high BVD and LVD counts, and In the scenario of invasion and metastasis, we evaluated the immunoexpression of the endoglycosidase heparanase and of the metastasis suppressor RKIP (Raf kinase inhibitor protein). Heparanase was upregulated in the malignant urothelium, and exhibited a heterogeneous pattern, with the invasion front of the tumours being more intensely stained than the tumour’s core, supporting its role in the disassembly of the extracellular matrix as an invasion-promoter mechanism. An opposite pattern was found when evaluating RKIP immunoexpression. This metastasis-supressor biomarker was homogeneously expressed in normal urothelium and in tumour sections with a favourable clinico-pathological profile. Heterogeneous expression, with the tumour centre being more intensely stained than the invasion front, associated with LI occurrence. Low RKIP expression significantly impaired prognosis, remaining as an independent prognostic factor for disease-free survival. Thus, RKIP loss emerges as a novel biomarker of UBC aggressiveness, and additional studies are necessary to validate our results and to further explore therapeutic strategies that can potentially restore RKIP functionality as a suppressor of bladder cancer metastases. Reprogramming cellular energetics and modeling the tumour microenvironment are inherent traits of malignancy. Among the plethora of biomarkers associated with this hallmark of cancer, we investigated the immunoexpression of CD147, monocarboxylate transporters (MCTs), CD44 and carbonic anhydrase (CA) IX. We observed that MCT1 and MCT4 were overexpressed in malignant urothelial cells, associating with an unfavourable clinicopathological profile. MCT1 expression correlated with poor prognosis. Significant associations were found between the pattern of expression of CD147, MCT1 and MCT4, supporting the role of CD147 as a chaperone for MCTs. CD147 upregulation clearly associated with UBC aggressiveness and poor prognosis, lowering significantly disease-free and overall survival rates. When included in a scoring system of UBC aggressiveness, CD147 overexpression allowed an accurate discrimination of bladder cancer patients’ prognosis. There was a substantial concordance among CD44 and MCTs expressions, and CD44 and CD147, which suggests an interactive scenario where CD44, MCTs and CD147 cooperate in regulating the acidic microenvironment. Moreover, CD44 expression was also associated with UBC aggressiveness. CAIX exhibited a heterogeneous pattern of expression, being stronger at the hypoxic core of MI tumours or at the luminal face of papillary lesions, were its expression was predominant. CAIX expression correlated with MCT4, CD147 and CD44 expressions, supporting hypoxia as a trigger mechanism of the glycolytic phenotype. Importantly, the CD147/MCT1 double-positive profile associated with unfavourable clinico-pathological parameters and poor prognosis, and discriminated a poor-prognosis group within patients who received platinum-based chemotherapy. These interesting results led us to further investigate CD147 as a potential biomarker of aggressiveness and cisplatin resistance in UBC cell lines. CD147 specific downregulation was accompanied by a decrease in MCT1 and MCT4 expressions and, importantly, an increase in chemosensitivity to cisplatin. Our findings shed light into the putative role of CD147 and its interactions in determining progression and resistance to cisplatin-based chemotherapy in UBC setting, unraveling possibilities for target therapeutic intervention that urge to be investigated. In summary, the results herein reported represent our contribution to a better understanding on biological parameters that seem to influence bladder cancer aggressiveness and chemoresistance, and should be further explored as potential prognosis/theranostics biomarkers and/or therapeutic targets.

O carcinoma urotelial da bexiga (CUB) representa um importante problema de saúde pública, em resultado da heterogeneidade associada à sua histogénese e comportamento clínico. A morbilidade e mortalidade associadas ao CUB são principalmente causadas pela variante músculo-invasora (MI), que representa cerca de 20-30% de todos os casos diagnosticados. Adicionalmente, uma proporção significativa de tumores não-músculo invasivos (NMI) de alto risco recidiva após a ressecção transuretral e progride para formas invasoras. Apesar de submetidos a cistectomia radical, metade dos doentes com tumores MI desenvolvem metástases. Em casos de CUBs localmente avançados ou disseminados, são recomendados esquemas de quimioterapia sistémica peri-operatória e paliativa. No entanto, potenciais benefícios em termos de sobrevivência são francamente diminuídos numa proporção significativa de doentes que apresentam quimio-resistência intrínseca ou adquirida. Atualmente, o prognóstico de doentes com CUBs MI é gravemente prejudicado pela dificuldade que os fatores de risco clínico-patológicos clássicos apresentam em prever, com precisão e por indivíduo, resultados dos tratamentos. Este grande entrave poderá ser potencialmente superado se biomarcadores de agressividade tumoral e resposta à quimioterapia forem rotineiramente avaliados e incluídos nos relatórios de patologia. Os esforços de pesquisa atuais são, cada vez mais, direcionados para a elaboração de nomogramas que combinem parâmetros clínicos padrão com possíveis biomarcadores. Nesta linha de investigação, o projeto descrito nesta tese teve como objetivo principal caracterizar um fenótipo de agressividade do CUB numa série de tumores, estudando o significado clínico e prognóstico de um painel de biomarcadores distintos que, apesar de pouco explorados no âmbito dos CUBs, foram já descritos como mediadores da angiogénese e linfangiogénese tumorais, invasão e metastização, e remodelação do metabolismo energético e do microambiente tumoral. Adicionalmente, pretendeu-se validar potenciais alvos terapêuticos em ensaios in vitro. A ocorrência de angiogénese, linfangiogénese e invasão linfovascular (IL) foi avaliada através de marcação imuno-histoquímica, recorrendo a anticorpos anti- CD31 (marcador de células endoteliais sanguíneas), D2-40 (marcador de células endoteliais linfáticas), VEGF-C (fator linfangiogénico, vascular endotelial growth factor C) e VEGFR-3 (recetor de VEGF-C). A marcação específica dos endotélios sanguíneo e linfático contribuiu significativamente para uma avaliação precisa da ocorrência de IL, e para uma distinção específica entre invasão vascular sanguínea (IVS) e invasão vascular linfática (IVL). Foram encontradas correlações entre densidade vascular sanguínea (DVS) e densidade vascular linfática (DVL) elevadas, progressão tumoral e ocorrência de IL. A ocorrência de IVS por êmbolos de células malignas identificada pela marcação específica com CD31, assim como a ocorrência de IVL por células malignas isoladas identificada pela marcação específica com D2-40, diminuíram significativamente a sobrevivência global. A ocorrência de IVS foi identificada como um fator independente de prognóstico. Quando incluídas num modelo de agressividade do CUB que combinou parâmetros clínico-patológicos clássicos com biomarcadores, a ocorrência de IVS e IVL contribuiu para a distinção entre grupos de baixa e elevada agressividade. O aumento de expressão de VEGF-C associou-se a um fenótipo de agressividade tumoral caracterizado pelo incremento do estádio patológico, perda de diferenciação, contagens de DVS e DVL elevadas, e ocorrência de IVS e IVL. O VEGFR-3 foi expresso, de forma monótona e consistente, pelo urotélio maligno. Tais resultados suportam a necessidade de estabelecer um método reprodutível de avaliação da ocorrência de IL que possa ser incorporado na prática clínica. Destaca-se o potencial papel deste processo biológico na seleção de doentes que poderão beneficiar de tratamentos adjuvantes. Os níveis de p-mTOR (phospho–mammalian target of rapamycin), bem como a possível associação com a ocorrência de angiogénese e linfangiogénese, foram igualmente estudados, na tentativa de clarificar o papel da via mTOR como mediadora de neovascularização no CUB. Foram selecionadas secções tumorais com representação de mucosa não-tumoral adjacente. Observou-se imunoexpressão nas células em guarda-chuva do urotélio não-tumoral, em todas as camadas celulares do urotélio de tumores NMI (de maior intensidade nas células superficiais), e em spots de células nas lesões MI. A expressão do p-mTOR diminuiu com o aumento do estádio tumoral, mas os poucos tumores pT3/pT4 positivos associaram-se a piores prognósticos. Por outro lado, a ocorrência de angiogénese ficou comprometida nos tumores pT3/pT4 negativos. Será necessário realizar estudos adicionais direcionados aos restantes membros desta via de sinalização, na tentativa de clarificar os resultados agora obtidos. Com o objetivo de explorar os fenómenos de invasão e metastização no CUB, avaliou-se a imunoexpressão da endoglicosidase heparanase e do supressor de metástases RKIP (Raf kinase inhibitor protein). Observaram-se níveis aumentados de heparanase no urotélio maligno, que exibiu um padrão heterogéneo, onde a frente de invasão tumoral se encontrava mais intensamente marcada do que o centro dos tumores, o que suporta o papel desta enzima na degradação da matriz extracelular, um mecanismo promotor de invasão. Em relação à proteína RKIP, foi encontrado um padrão de expressão oposto. Este biomarcador supressor de metástases foi homogeneamente expresso no urotélio normal e em secções tumorais caracterizadas por um perfil clínico-patológico favorável. Uma expressão heterogénea, com o centro do tumor mais intensamente marcado do que a frente de invasão, associou-se à ocorrência de IL. A diminuição da expressão de RKIP associou-se significativamente a um prognóstico desfavorável, mantendo-se como um fator independente de prognóstico relativamente à sobrevivência livre de doença. Assim, a perda de expressão de RKIP surge como um novo biomarcador de agressividade do CUB. Estudos adicionais são necessários para validar os resultados aqui apresentados e explorar estratégias terapêuticas que possam potencialmente restaurar a funcionalidade desta proteína como um supressor de metástases no carcinoma da bexiga. A reprogramação do metabolismo energético e a modelação do microambiente tumoral são características inerentes ao fenótipo de malignidade. Entre a diversidade de biomarcadores associados a tais fenómenos, foi estudada a imunoexpressão de CD147, de transportadores de monocarboxilatos (monocarboxylate transporters, MCTs), de CD44 e de anidrase carbónica (carbonic anhydrase, CA) IX. Verificou-se o aumento da expressão de MCT1 e MCT4 nas células uroteliais malignas. Os tumores negativos apresentaram perfis clínico-patológicos favoráveis. A expressão de MCT1 associou-se a um prognóstico desfavorável. Foram encontradas associações significativas entre o padrão de expressão de CD147, MCT1 e MCT4, o que fundamenta o papel da proteína CD147 como chaperone dos MCTs. O aumento da expressão de CD147 associou-se claramente a um fenótipo de agressividade tumoral e a um prognóstico adverso, reduzindo significativamente as taxas de sobrevivência livre de doença e sobrevivência global. Quando incluída num sistema de discriminação de agressividade tumoral, a expressão de CD147 permitiu distinguir, com rigor, o prognóstico dos doentes com CUB. Verificou-se uma concordância significativa entre a expressão de CD44 e MCTs, e entre a expressão de CD44 e CD147, o que sugere um cenário interativo onde CD44, MCTs e CD147 cooperaram na regulação do microambiente tumoral. Além disso, a expressão de CD44 associou-se igualmente com a agressividade do CUB. A enzima CAIX exibiu um padrão de expressão heterogénea, sendo a marcação mais forte no centro hipóxico dos tumores MI ou na face luminal das lesões papilares, onde a sua expressão se revelou predominante. A expressão de CAIX associou-se com a expressão de MCT4, CD147 e CD44, o que sugere a ocorrência de hipoxia como um mecanismo promotor do fenótipo glicolítico. De salientar que o perfil duplamente-positivo CD147/MCT1 associou-se a parâmetros clínico-patológicos desfavoráveis e a um pior prognóstico, e discriminou um subgrupo de doentes com prognóstico adverso entre um grupo tratado com quimioterapia à base de compostos de platina. Tais resultados encorajaram à realização de estudos adicionais em linhas celulares de CUB, na tentativa de clarificar a função da proteína CD147 como um potencial biomarcador de agressividade tumoral e resistência à cisplatina. O silenciamento específico da CD147 foi acompanhado por uma diminuição da expressão de MCT1 e MCT4 e, notoriamente, por um aumento na quimio-sensibilidade à cisplatina. Estes estudos demonstram o papel provável da CD147 e suas interações na determinação da progressão tumoral e resistência à quimioterapia baseada em cisplatina em doentes com CUB, revelando possibilidades de intervenção terapêutica dirigida que devem ser exploradas num futuro próximo. Em resumo, os resultados descritos nesta tese representam o tributo para uma melhor compreensão sobre parâmetros biológicos que parecem influenciar a agressividade do carcinoma urothelial da bexiga, bem como a resistência à quimioterapia, e que devem ser investigados como potenciais biomarcadores de prognóstico e previsão de resposta à terapêutica, bem como alvos terapêuticos.