Bioactive glass nanoparticles combined with natural-based polymers for biomedical applications

Abstract

Bone tissue engineering has assisted in the last decades to an evolution in which merely replacement implants gave room to more complex regenerative approaches. Several challenges still remain. Although biocompatibility and biodegradability mechanism are now reasonably known and controlled, they still need to precisely match the physiological rhythm of bone renewal, while maintaining the adequate structural properties to support the host tissue growth. These mechanisms are first regulated at the nanoscale through the cellular interactions with the materials. Therefore, there is an urge to begin the control of materials surface interaction with the environment at the nanoscale and to go up to the micro and macro levels that are comprised in the natural bone structure. The main goal of this thesis was to give a step further in producing in vitro materials able to mimic the structural and chemical environment necessary to bone growth. Therefore, micro and nanofabrication techniques were used to recapitulate the complex environment of mineralized tissues. As bone is based in a mineral/organic natural composite, bioactive glass and chitosan were chosen as materials to be combined in order to mimic bone structure. Bioactive glass was engineered at the nanoscale, to better follow Nature´s path. In a first stage of the work, the production of bioactive glass nanoparticles was studied and optimized. The influence of changing experimental parameters such as temperature and pH were evaluated, as well as the composition of the BG-NPs. All of the considered factors showed to be important when setting important characteristics of the BG-NPs as size, morphology and bioactivity. A ternary and a binary system were compared. The different characteristics showed by both systems indicate that in the future, it will be easy to adapt the BG-NPs to the environment requirements, namely degradation rate and subsequently ionic release to assure efficiently hydroxyapatite layer deposition necessary for bone growth while maintaining safe cytotoxicity levels Following of the BG-NPs evolution in the sol-gel system since the early stages of production showed that hollow BG-NPs are easily obtained through Ostwald-ripening. This template free route presents a great potential for drug-delivery systems. Moreover, the procedure may be simply adapted to produce dense nanospheres with controllable sizes, only through the addition of different PEG size chains. Chitosan, a natural origin polymer, was then combined with the developed bioactive glass nanoparticles to obtain nanocomposites. Two strategies were followed. BG-NPs were dispersed in a chitosan solution and then transformed in membranes through a traditional solvent casting procedure. Bioactive polymeric nanocomposites were easily obtained by using different BG-NPs (from a ternary system based on SiO2-CaO-P2O5 and a quaternary system based on SiO2-CaO-P2O5-MgO). Both the bioactivity potential and the osteoblastic response in vitro were evaluated. A microcontact printing technique was employed to print BG-NPs on the surface of the chitosan membranes. Mineralized patterns were obtained and cells showed a tendency to attach accordingly to the created pattern. Finally, moving up to the 3D level, a novel bottom-up approach was addressed aiming to summarize bone´s natural multihierarchical structure. In this work, it was proved in a very simple procedure, how a drop of aqueous suspension of BG-NPs left to dry on a superhydrophobic surface leads to the self-assembly of the BG-NPs, creating a bioactive glass based aggregate comprising the nano, micro and macro levels. Besides having a hierarchical organization, that is known to give mineralized materials their great mechanical properties, these systems also allow for the inclusion of drugs as was proved by dispersing dyeing additives in the macrospheres. Their bioactive character may also be adapted to the host tissue requirements by changing the water evaporation ratio only by adjusting the environment temperature. The topics explored in this this thesis contributed for a deeper understanding of the BG-NPs production. Moreover, the described research work is based on simple techniques highly competitive against other existing technologies for bone´s structure mimicking.

Nas últimas décadas, a Engenharia de Tecidos ósseos, assistiu a uma extraodinária evolução. O desenvolvimento de implantes com funções de mero suporte deu lugar a complexas estratégias de regeneração do osso. Apesar dos significativos avanços obtidos nesta área, subsistem ainda importantes desafios. Actualmente os mecanismos na base dos conceitos de biocompatibilidade e degradabilidade são já conhecidos e razoavelmente controlados. Persiste no entanto a necessidade de adequar estes conceitos, de um modo efectivo, aos ritmos fisiológicos da renovação óssea. Estes mecanismos começam por ser regulados à nanoescala através de interacções celulares com a superfície dos materiais e estendem-se para aos níveis micro e macrométrico. O principal objectivo desta tese prendeu-se com a necessidade de produzir in vitro, materiais capazes de mimetizar estrutural e quimicamente o complexo ambiente necessário ao crescimento de tecido ósseo saudável. Neste sentido, técnicas de fabricação à escala nano e micro foram utilizadas com intenção de reproduzir a estrutura dos tecidos naturalmente mineralizados. Sendo o osso um compósito natural baseado numa fase mineral e orgânica, os materiais escolhidos para reproduzir esta combinação foram o vidro bioactivo e o quitosano. No caso do vidro bioactivo, este foi trabalhado à nanoescala, para melhor reproduzir as estratégias encontradas na Natureza. Numa primeira fase da investigação, a produção de nanopartículas de vidro bioactivo foi estudada e optimizada. A influência de algumas condições experimentais, nomeadamente a temperatura e o pH, foi avaliada, tal como a composição química das nanopartículas. Todos os pontos considerados mostraram ser relevantes para definir características importantes como o tamanho das nanopartículas, a morfologia e a bioactividade. Dois sistemas diferentes de vidro bioactivo ternário e binário foram comparados. As diferentes características mostradas por ambos os sistemas, demonstram que no Futuro, as propriedades das nanopartículas podem ser facilmente adaptadas aos requisitos do local de implantação. O acompanhamento da evolução das nanopartículas de vidro bioactivo no sistema sol-gel, desde os seus primeiros momentos de formação, mostra que é possível obter nanopartículas ocas através do fenómeno de amadurecimento de Ostwald. Este procedimento não envolve a necessidade de recorrer a um molde para criar estruturas ocas e oferece um grande potencial para sistemas de libertação de fármacos. O procedimento foi ainda adaptado de modo a que nanoesferas densas, com tamanhos controláveis, fossem obtidas unicamente devido à adição de cadeias PEG com diferentes tamanhos. O quitosano, um polímero de origem natural, foi combinado com as nanopartículas desenvolvidas de modo a obter nanocompósitos de material orgânico e inorgânico. Para este propósito, duas estratégias diferentes foram seguidas. Numa primeira abordagem, as nanopartículas de vidro bioactivo foram dispersas numa solução de quitosano e posteriormente processadas em membranas por evaporação do solvente. Como resultado, obtiveram- se nanocompósitos bioactivos de base polimérica usando diferentes nanopartículas de vidro bioactivo (sistema ternário SiO2-CaO-P2O5 e sistema quaternário SiO2-CaO-P2O5-MgO). Tanto o potencial bioactivo quanto a resposta osteoblástica foram avaliados in vitro. Numa segunda abordagem, a técnica de impressão por microcontacto foi utilizada para criar padrões mineralizáveis de nanopartículas de vidro bioactivo na superfície de membranas de quitosano. As células cultivadas sobre estes substratos alinharam-se de acordo com o padrão previamente formado. Finalmente, ao nível 3D, uma nova estratégia foi seguida tendo em vista a obtenção de estruturas multihierárquicas semelhantes às encontradas no osso. A deposição de gotas de suspensão aquosa de nanopartículas de vidro bioactivo em superfícies superhidrofóbicas permitiu, por associação espontânea induzida por evaporação, a obtenção de agregados esféricos de nanopartículas, exibindo níveis de organização à escala nano, micro e macrométrica. Os tópicos explorados nesta tese contribuem para uma melhor compreensão da produção de nanopartículas de vidro bioactivo. O trabalho de investigação aqui descrito baseou-se em técnicas simples e altamente competitivas em oposição a outras técnicas já existentes com vista à mimetização da estrutura óssea.