Role of secreted aspartyl proteases in Candida albicans virulence, host immune response and immunoprotection in murine disseminated candidiasis

Abstract

The polymorphic yeast Candida albicans is an important opportunistic human pathogen and the most common causative agent of fungal invasive infections. Host physical barriers and immune system integrity are crucial factors in controlling the establishment of Candida infections. However, the high adaptability of C. albicans to different host niches is also a determinant factor. The host-fungus interplay is dynamic and the balance between fungal elimination and tissue damage depends on both the host response and how the pathogen reacts to immune effector molecules and cells. The murine model of hematogenously disseminated C. albicans infection is widely used to ascertain strain virulence and host-fungus interactions. However, distinct C. albicans strains may present distinct virulence phenotypes and elicit quantitatively and qualitatively different immune responses. Hence, results obtained with one strain cannot be taken as representative of the whole species. Moreover, most studies focused on C. albicans internalization and killing by phagocytes, rather than on the overall immune response. Here, a comparative analysis of the early immune response, host survival and kidney fungal burden was done in mice infected intravenously with three C. albicans strains with different attributed virulence, SC5314, ATCC 90028 and ATCC 32354. Strain SC5314 was the most virulent and elicited a more marked inflammatory response, with higher neutrophil recruitment. In contrast, ATCC 32354 presented the lowest virulence and stimulated less markedly the innate immune response than the other strains. These results provide additional evidence on the association between C. albicans virulence and the early immune response, which may be useful in delineating vaccination or immunotherapeutic strategies against disseminated candidiasis. Secretion of C. albicans hydrolytic enzymes during infection is a virulence attribute that aids adhesion to and invasion of host tissues, and immune evasion. Among these enzymes, secreted aspartyl proteases (Sap) encoded by a 10-member gene family (SAP1 to SAP10) have been particularly studied. Several members of the Sap family were claimed to play a significant role in the progression of candidiasis established by the hematogenous or intraperitoneal routes. This assumption was based on the observed attenuated virulence of sap-null mutant strains. However, the exclusive contribution of SAP genes to their attenuated phenotype was not unequivocally confirmed, as the Ura status of several mutant strains could also have contributed to the attenuation. In this study, the importance of SAP1 to SAP6 in murine models of hematogenously disseminated candidiasis and C. albicans peritonitis was reassessed by using sap-null mutant strains not affected in their URA3 gene expression. In systemic candidiasis established by intravenous infection, SAT1-flipping constructed Δsap123 and Δsap456 mutants did not present a significant reduction in virulence contrasting the attenuated virulence found in equivalent Ura-blaster mutants. Using the newly assessed mutant strains, the median survival time of BALB/c mice infected with the Δsap123 strain was similar to that of wild-type (WT) SC5314-infected mice, while those infected with mutant strains lacking SAP5 showed slightly extended survival times. Nevertheless, WT and Δsap456 strains were equally able to invade mice kidneys. Likewise, SAP4 to SAP6 deficiency had no noticeable impact on the immune response elicited in the spleen and kidneys of C. albicans-infected mice. These results suggest that Sap1 to Sap6 do not play a significant role in C. albicans virulence in the murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Contrastingly, in the murine model of C. albicans peritonitis, Δsap456-infected mice presented lower kidney fungal burden than WT- or Δsap123-infected mice. WT-infected mice presented higher proportions of T regulatory cells (Foxp3+) in the spleen and mesenteric lymph nodes than non-infected or sap-null mutant-infected counterparts. In addition, CD4+CD25+ T cells of WT-infected mice were the most effective in suppressing the proliferative response of CD4+CD25- T cells whereas those of Δsap456-infected mice were the least suppressive. Furthermore, CD4+ T cells of WT-infected mice were the ones producing the highest levels of IL-10. Interestingly, Δsap456-infected mice presented less Foxp3+ cells in kidney lesions than the other fungal challenged mice. Altogether, these results implicate Sap4 to Sap6 in the host immune response to C. albicans peritonitis, providing additional evidence for the role of these enzymes in this infection model. To circumvent host immune defenses, C. albicans developed multiple evasion mechanisms. Among these, production of Saps has been particularly highlighted due to their ability to degrade and/or inactivate diverse host immune effector molecules. The mammalian pattern recognition receptor galectin-3 (Gal-3) was shown to specifically bind β-1,2 mannosides on C. albicans cell wall. This interaction directly induces fungal cell death and also promotes pro-inflammatory cytokine TNF-α production by host cells. In this study, we assessed whether this lectin could be degraded by native Sap2 or recombinant Sap1 to Sap3 isoenzymes. All C. albicans Saps tested degraded and inactivated the host receptor Gal-3. This may constitute a fungal strategy to control and evade host immune mechanisms dependent on Gal-3. Degradation of this protein might thus generate a protective microenvironment of reduced Gal-3 activity, which may facilitate C. albicans survival in the host. Previous reports have shown that mice immunized with Sap2 were protected against mucosal or peritoneal C. albicans infection. Here, we extended these studies and evaluated the suitability of C. albicans recombinant Sap2 (rSap2) as protective immunogen for vaccination against hematogenously disseminated candidiasis. Four different immunogenic preparations were tested, respectively using Alum, Imiquimod, Freund’s or CpG plus Alum as adjuvants. Moreover, as the hypha-associated isoenzyme Sap5 is preferentially expressed during systemic candidiasis, it was also evaluated as target antigen for Candida vaccination, together with Alum or Imiquimod. All these approaches failed in protecting the immunized mice from fungal infection. This suggests that the C. albicans enzymes Sap2 and Sap5, despite their potential role in virulence, do not appear to be suitable target proteins in immunopreventive strategies against hematogenously disseminated candidiasis. In summary, results presented in this thesis provide additional evidence for the differential involvement of Saps in distinct C. albicans infection models. Moreover, these results, by showing that host immune response to C. albicans is affected by lack of SAP expression, are in support of a previously hypothesized immunomodulatory role for Saps. Finally, the lack of host immune protection against hematogenously disseminated candidiasis by means of Sap immunization reinforces the limited role of these proteins in this type of infection.

A levedura polimórfica Candida albicans é um importante patógeno oportunista em humanos, sendo o mais frequente agente causador de infeções fúngicas invasivas. A integridade das barreiras físicas do hospedeiro, bem como do seu sistema imunitário, são fatores cruciais no controlo de infeções por leveduras do género Candida. Todavia, a grande adaptabilidade de C. albicans a diferentes nichos do hospedeiro é também um fator determinante. As interações fungo-hospedeiro são dinâmicas e o equilíbrio entre a eliminação do fungo e o dano tecidular depende tanto da resposta do hospedeiro, como da forma como o patógeno reage às células e moléculas imunitárias. O modelo de candidíase sistémica originada pela via endovenosa em murganhos é amplamente utilizado para avaliar a virulência das estirpes e as interações entre fungo e hospedeiro. No entanto, estirpes diferentes de C. albicans podem apresentar fenótipos de virulência distintos e desencadear respostas imunitárias, quer qualitativa, quer quantitativamente, diferentes. Deste modo, os resultados obtidos com uma estirpe não poderão ser considerados representativos da espécie. Além disso, a maioria dos estudos incidiram na internalização e morte de C. albicans por células fagocíticas, em detrimento da resposta imunitária global. Nesta tese foi feita uma análise comparativa da resposta imunitária precoce, da carga fúngica renal e da sobrevivência de murganhos infetados pela via endovenosa com três estirpes de C. albicans, com reconhecidas diferenças de virulência, SC5314, ATCC 90028 e ATCC 32354. A estirpe SC5314 foi a mais virulenta e desencadeou uma resposta inflamatória mais exuberante, com um maior recrutamento de neutrófilos. Pelo contrário, a estirpe ATCC 32354 foi a menos virulenta e estimulou menos a resposta imunitária do que as outras estirpes. Estes resultados reforçam a associação entre a virulência de C. albicans e a resposta imunitária precoce, o que poderá ser útil no planeamento de estratégias de vacinação ou imunoterapêuticas contra a candidíase disseminada. A secreção de enzimas hidrolíticas por C. albicans durante a infeção é considerada um fator de virulência que auxilia a adesão e invasão de tecidos do hospedeiro e a evasão à resposta imunitária. Entre estas enzimas, as proteases aspárticas secretadas (Sap), codificadas pela família de genes SAP1 a SAP10 foram estudadas mais aprofundadamente. Foi atribuído um papel importante a vários membros desta família na progressão da candidíase estabelecida pelas vias endovenosa e intra-peritoneal. Para tal contribuíram a virulência atenuada observada em mutantes deficientes nestas proteases. Contudo, o contributo exclusivo dos genes SAP para o fenótipo observado não foi inequivocamente demonstrado, uma vez que a inserção ectópica do gene URA3 em vários mutantes poderá ter contribuído para a diminuição da virulência. Neste estudo reavaliou-se a importância dos genes SAP1 a SAP6 na infeção disseminada por via endovenosa e na peritonite causada por C. albicans, usando mutantes deficientes nestes genes sem expressão de URA3 afetada. Na candidíase sistémica estabelecida pela via endovenosa, os mutantes Δsap123 e Δsap456, construídos pelo método “SAT1-flipping” não apresentaram uma redução significativa na virulência, contrariamente ao observado nos mutantes correspondentes, construídos pelo método “Ura-blaster”. Utilizando os mutantes novos, o tempo médio de sobrevida de murganhos BALB/c infetados com o mutante Δsap123 foi muito semelhante ao observado em murganhos infetados com a estirpe selvagem SC5314, enquanto os murganhos infetados com mutantes deficientes na expressão do gene SAP5 tiveram tempos de sobrevida ligeiramente mais alargados. No entanto, tanto a estirpe selvagem, como o mutante Δsap456, foram igualmente capazes de invadir os rins de murganhos infetados. Da mesma forma, a deficiência na expressão de SAP4 a SAP6 não afetou significativamente a resposta imunitária desencadeada, quer no baço, quer nos rins, de murganhos infetados com a levedura. Estes resultados sugerem que as Sap1 a Sap6 não desempenham um papel essencial na virulência de C. albicans no modelo de candidíase sistémica estabelecido pela via endovenosa. Pelo contrário, no modelo de peritonite causado por C. albicans, os murganhos infetados com a estirpe Δsap456 apresentaram carga fúngica renal menor do que a dos murganhos infetados com as estirpes selvagem ou Δsap123. Os murganhos infetados com a estirpe selvagem apresentaram frequências de células T reguladoras (Foxp3+) superiores às observadas nos murganhos infetados com as estirpes mutantes, tanto no baço como nos gânglios linfáticos mesentéricos. Além disso, as células T CD4+CD25+ de murganhos infetados com a estirpe selvagem suprimiram de modo mais marcado a proliferação de células T CD4+CD25- do que as células correspondentes de murganhos infetados com as estirpes mutantes, enquanto as células de murganhos infetados com a estirpe Δsap456 apresentaram o fenótipo menos supressor. Adicionalmente, as células T CD4+ de murganhos infetados com a estirpe selvagem foram as que produziram níveis mais elevados de IL-10. É particularmente interessante a observação de uma menor presença de células Foxp3+ nas lesões renais de murganhos infetados com o mutante Δsap456 em comparação com o observado nos murganhos infetados com as outras estirpes. O conjunto dos resultados obtidos implica o envolvimento das enzimas Sap4 a Sap6 na resposta imunitária à peritonite causada por C. albicans, acrescentando informação adicional sobre o papel destas proteases neste modelo de infeção. C. albicans desenvolveu diversos mecanismos para ultrapassar a defesa imunitária do hospedeiro. Entre eles, destaca-se a produção de Saps pela capacidade destas enzimas em degradar e/ou inativar diversas moléculas da resposta imunitária do hospedeiro. O recetor de padrões microbianos galectina-3 (Gal-3) liga especificamente oligomanosídeos β-1,2 presentes na parede celular de C. albicans. Esta interação induz a morte da levedura e promove a produção da citoquina pro-inflamatória TNF-α pelas células do hospedeiro. Neste estudo foi avaliada a degradação da Gal-3 pelas Sap2 nativa e Sap1, Sap2 e Sap3 recombinantes. Todas as Saps testadas foram capazes de degradar e inativar a Gal-3. Esta poderá constituir uma estratégia para controlar e evadir os mecanismos imunitários dependentes de Gal-3. A degradação deste recetor poderá originar um microambiente de atividade Gal-3 reduzida, o que poderá facilitar a sobrevivência do patogéneo no hospedeiro. Estudos prévios mostraram que murganhos imunizados com Sap2 ficaram protegidos contra a candidíase mucocutânea e contra a peritonite causada por C. albicans. Aqui, alargamos estes estudos e avaliamos a adequação do uso das Sap2 recombinante (rSap2) como imunogénio para vacinação contra a candidíase sistémica estabelecida por via endovenosa. Foram testadas quatro formulações imunogénicas diferentes, utilizando como adjuvantes Alum, Imiquimod, Freund e uma mistura de CpG e Alum. Adicionalmente, como a isoenzyma Sap5 é expressa preferencialmente durante a candidíase sistémica, foi igualmente avaliado o seu uso como antigénio alvo para vacinação contra a doença, utilizando Alum ou Imiquimod como adjuvantes. Nenhuma das preparações testadas resultou na proteção dos murganhos imunizados contra a infeção fúngica. Estes resultados sugerem que as enzimas Sap2 e Sap5, apesar do seu potencial papel na virulência de C. albicans, poderão não ser proteínas-alvo adequadas xvi para utilização em estratégias imuno-preventivas contra a candidíase sistémica estabelecida pela via endovenosa. Em resumo, os resultados apresentados nesta tese fornecem informações adicionais sobre o envolvimento diferencial das Saps em modelos de infeção distintos. Além disso, estes resultados, ao mostrarem que a resposta imunitária do hospedeiro é afetada pela falta de expressão de genes SAP, suportam um papel imuno-modulador das Saps que havia sido previamente sugerido. Finalmente, a falta de proteção imunitária do hospedeiro contra a candidíase sistémica estabelecida pela via endovenosa reforça o papel limitado destas proteases neste tipo de infeção