Characterisation of Arabidopsis thaliana heat-responsive RNA-binding protein (HRR) gene: molecular roles in plant thermotolerance and development

Abstract

Plants face a multiplicity of biotic and abiotic stresses, of which the most typical are extreme temperatures. High temperatures cause considerable morphological, physiological and molecular alterations that adversely affect plant growth and productivity. The acquisition of thermotolerance is controlled by activation and regulation of specific stress-related genes that lead to adjustments on plant transcriptome and proteome. From a previous transcriptomic analysis of heat-stressed Arabidopsis seedlings, the HRR gene was singled out by presenting a specific high heat-stress response. The principal aim of this work is the functional characterisation of this uncharacterized gene. At the end, this work is expected to contribute for the general understanding of RNA-binding proteins involvement in heat stress responses. These proteins are expected to be associated to the transcriptome organisation responsible for adaptation to heat stress, as well during plant development. The in silico analysis revealed that HRR codes for a putative RNA-binding protein, containing a RRM domain and a PABP-1234 functional domain. HRR was predicted to be highly expressed under heat stress conditions. However, HRR seems to present a basal expression throughout the plant life cycle, being prevised the highest levels during flower development, seed maturation and germination. The predicted co-interaction with other Arabidopsis RRM-containing proteins (UBP1 and RBP45 proteins) and phylogenetic relationship with metazoan orthologues suggests that HRR could play functions in the stability of HS-induced transcripts. The phenotypic analysis of hrr loss-in-function and HRR over-expression mutant lines showed that HRR seems to be strongly involved in plant thermotolerance responses, at least during seed germination. In opposition to bioinformatic data, HRR appears to be also involved in responses to salt stress imposition. Furthermore, HRR was suggested to be a positive regulator in the metabolism and signalling of phytohormone ABA. When seedlings were subjected to heat stress, the HRR expression analysis revealed that HRR transcripts are subjected to alternative splicing process, originating the canonical HRR.1 and intron-retained HRR.2 transcripts. A mRNA decay analysis suggested that HRR.2 transcripts could of HS-induced transcripts. be considered good targets for RNA degradation, most likely through nonsense mRNA decay mechanisms. The alternative splicing mechanism was not always evident. In seeds, either subjected or not to heat stress, HRR.1 was the only transcript to be originated. Therefore, depending on plant development stage, HRR proteins could display slightly different functional roles. HRR proteins appear to be crucial in the regulation of other heat stress-responsive transcripts (HSFs and HSPs). In agreement with bioinformatic analysis, HRR is expressed during the later stages of seed maturation and during transition from seed dormancy to germination phases. During these stages, HRR seems to modulate a set of seed-specific transcripts, namely ABI5, Em6, HSFA9 and HSP101. ABA biosynthesis (ABA1 and NCED9) and SPY (GA metabolism negative regulator) transcripts seem to be also regulated by HRR, during seed germination. In vitro localisation assays suggested that HRR proteins appear to follow distinct subcellular pathways during HS imposition. Initially, HRR.1 was found in the nucleus, being then recruited for cytoplasmic granules and nuclear pores. HRR.2 was mainly found in cytoplasmic granules but was also present in nuclear speckles. The localisation of both proteins in cytoplasmic aggregates suggests that they could be present in stress granules (SGs) and/or processing bodies (PBs). Transcriptional- and translational-inhibition experiments demonstrated that HRR.1 could be strongly involved in SG biogenesis, while HRR.2 could interfere in both SG and PB activities. The approaches used in this work to investigate the HRR function have disclosed the role of this protein in heat-stress responses and during seed development and germination. Further research on these proteins will strength the current knowledge about the RNA metabolism under heat stress conditions. However, the key features of plant RNA-binding proteins in abiotic stress responses and plant development have just begun to be uncovered and many questions remain still to be answered.

As plantas estão continuamente a ser sujeitas a uma multiplicidade de stresses bióticos e abióticos, sendo que as temperaturas extremas são a forma mais comum de stresse abiótico. As temperaturas elevadas provocam consideráveis alterações morfológicas, fisiológicas e moleculares nas plantas, as quais afetam negativamente o seu crescimento e desenvolvimento. A aquisição de termotolerância é efetuada pela ativação e regulação de genes específicos para a resposta ao stresse, conduzindo a ajustamentos no transcriptoma e proteoma da planta. Da prévia análise transcriptómica efetuada em plântulas de Arabidopsis sujeitas a stresse pelo calor, o gene HRR foi selecionado por apresentar uma específica e elevada resposta ao stresse pelo calor. O principal objetivo deste trabalho é a caracterização funcional deste gene de função desconhecida. No final deste trabalho espera-se que a caracterização funcional de HRR contribua para o maior conhecimento da funcionalidade das proteínas de ligação ao RNA nas respostas ao stresse pelo calor. Estas proteínas provavelmente estão associadas à re-organização do transcriptoma, a qual será responsável pela adaptação ao stresse pelo calor e em diferentes fases do desenvolvimento vegetal. A análise in silico revelou que o gene HRR codifica para uma putativa proteína de ligação ao RNA, sendo particularmente expresso sob condições de stresse pelo calor. No entanto, HRR parece apresentar uma expressão basal ao longo de todo o ciclo de vida da planta, estando previstos os níveis mais elevados durante o desenvolvimento floral, maturação das sementes e germinação. A previsão da co-interação de HRR com outras proteínas de Arabidopsis contendo o domínio RRM (proteínas UBP1 e RBP45) e a sua relação filogenética com ortólogos de metazoários sugere que HRR pode desempenhar funções na estabilidade de transcritos induzidos durante o stresse pelo calor. A análise fenotípica de linhas mutantes de HRR com perda- (hrr) e ganho-de-função (sobreexpressão) demonstrou que HRR pode estar fortemente envolvida nas respostas de termotolerância, pelo menos durante a germinação das sementes. Em oposição aos dados bioinformáticos, HRR parece também estar envolvido nas respostas ao stresse salino. Foi igualmente sugerida a função de HRR como regulador positivo no metabolismo e sinalização da fitohormona ABA. Quando plântulas foram submetidas ao stresse pelo calor, a análise de expressão de HRR revelou que os transcritos de HRR são sujeitos a um processo de excisão alternativa, originando o já descrito transcrito HRR.1 e o transcrito HRR.2 que apresenta retenção de um intrão. A análise de decaimento de mRNA sugeriu que os transcritos de HRR.2 podem ser considerados potenciais alvos de degradação, provavelmente através de mecanismos de decaimento de mRNA nonsense. O mecanismo de excisão alternativa nem sempre é verificado. Nas sementes, quer sejam sujeitas ou não ao stresse pelo calor, o único transcrito produzido é HRR.1. Deste modo, dependendo da fase de desenvolvimento, as proteínas HRR poderão apresentar ligeiras diferenças funcionais. As proteínas HRR parecem ser importantes para a regulação de transcritos induzidos durante a resposta ao stresse pelo calor (HSFs e HSPs). De acordo com a análise bioinformática, HRR é expresso durante as últimas fases da maturação das sementes e durante a transição do estado de dormência para a germinação. Durante estas fases, HRR parece modular um grupo específico de genes, nomeadamente ABI5, Em6, HSFA9 e HSP101. Os transcritos para enzimas envolvidas na biossíntese de ABA (ABA1 e NCED9) e de SPY (regulador negativo no metabolismo do GA) parecem também ser regulados por HRR durante a germinação. Ensaios in vitro de localização subcelular sugerem que as proteínas HRR seguem vias subcelulares diferentes, durante a imposição de stresse pelo calor. Inicialmente, HRR.1 foi encontrada no núcleo, sendo depois recrutada para grânulos citoplasmáticos e poros nucleares. HRR.2 foi maioritariamente encontrada nos grânulos citoplasmáticos, estando também presente em agregados subnucleares. A localização das duas proteínas nos agregados citoplasmáticos sugere que ambas estão presentes em grânulos de stresse (SGs) e/ou corpos de processamento (PBs). Ensaios de inibição da transcrição e tradução sugerem que HRR.1 está fortemente envolvida na biogénese de grânulos de stresse, enquanto HRR.2 pode interferir na atividade de ambos os tipos de agregados citoplasmáticos. As abordagens utilizadas neste trabalho para estudar a função de HRR revelaram a função desta proteína nas respostas ao stresse pelo calor e durante o desenvolvimento das sementes e germinação. Trabalhos futuros sobre estas proteínas permitirão reforçar o conhecimento atual sobre o metabolismo do RNA em condições de stresse térmico pelo calor. Contudo, as característicaschave das proteínas de ligação ao RNA nas respostas ao stresse abiótico e desenvolvimento vegetal só começaram agora a ser desvendadas e muitas questões permanecem ainda por responder.