Nanostructured 3D constructs based on chitosan and chondroitin sulphate multilayers for cartilage tissue engineering

Abstract

Articular cartilage damage is a persistent and increasing problem with the aging population, and treatments to achieve biological repair remain a challenge. The lack of efficient modalities of treatments has prompted research into tissue engineering (TE). TE approaches are a promising strategy for improving the rate of repair of articular cartilage lesions by combining cells, biomaterials and microenvironmental factors. The work developed at this thesis was aimed to study the potential of nanostructured scaffolds based on layer-by-layer (LbL) methodology to be used in articular cartilage TE. The polyelectrolytes used for producing these structures were two polysaccharides: chitosan (polycation) and chondroitin sulphate (polyanion). These polyelectrolytes were chosen due to its biocompatibility and positive influence on cartilage. The sequential combination of these polyelectrolytes led to a decrease in frequency and increase in dissipation as seen using quartz microbalance (QCM), indicating the development of a multilayered film. For the proof of concept, biological assays were first performed in multilayered surfaces with bovine chondrocytes (bch). No cytotoxic effects of the film were found. Thus, the formation of a nanostructured film was transposed to a three-dimensional (3D) level combining LbL and leaching of spherical sacrificial templates. The homogenous distribution of polysaccharides in the scaffolds was confirmed by Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR). Morphological analysis of the scaffolds was based on scanning electron microscope (SEM), optical microscopy, and histology. The results showed a high porosity, which leads to swollen structure when immersed in phosphate buffered saline (PBS). The enzymatic degradation tests, using PBS and enzymatic solution with lysozyme and hyaluronidase, showed that the scaffold has a gradual degradation, and as expected the rate of degradation was higher in the enzymatic solution. Mechanical properties of the scaffold were evaluated using dynamic mechanical analysis (DMA). The results revealed that scaffold exhibit viscoelastic behaviour which corroborates the results obtained at QCM. The applicability of the nanostructured scaffold for cartilage was evaluated in cellular assays with bch and human mesenchymal cells (hMSCs). Tests of cell viability, SEM and quantification of DNA revealed that scaffolds promote cell adhesion and proliferation. Differentiation studies demonstrated the production of glycosaminoglycans (GAGs) by both cells. These results confirmed the maintenance of phenotype of bch and the chondrogenic differentiation of hMSCs. Thus, we believe the scaffolds developed may have potential use in cartilage TE approaches.

Os danos da cartilagem articular são um problema persistente e crescente com o envelhecimento da população, pelo que os tratamentos para obter a reparação biológica continuam a ser um desafio. A falta de tratamentos eficientes impulsionou a investigação de estratégias de engenharia de Tecidos (TE), as quais são estratégias promissoras para melhorar a taxa de reparação de lesões da cartilagem articular, combinando células, biomateriais e factores microambientais. O trabalho desenvolvido nesta tese teve como objectivo estudar o potencial de “scaffolds” nanoestruturados baseados na metodologia de “layer-by-layer” (LbL) para estratégias de TE da cartilagem articular. Os materiais utilizados para a produção destas estruturas foram dois polissacarídeos: o quitosano (policatião) e o sulfato de condroítina (polianião). Estes foram seleccionados devido à sua biocompatibilidade e influência positiva na cartilagem. A combinação sequencial destes polielectrólitos leva a uma diminuição da frequência e aumento da dissipação na microbalança de quartzo (QCM), indicando o desenvolvimento de um filme com multicamadas. Para comprovar a aplicabilidade destas estruturas, primeiramente foram realizados ensaios biológicos em superfícies com multicamadas, utilizando condrócitos bovinos (bch). O filme produzido não apresentou qualquer efeito citotóxico. Assim, a formação de um filme nanoestruturado foi transposta para o nível tridimensional (3D) combinando LbL com lixiviação de partículas de sacrifício esféricas. A presença dos polissacarídeos nos “scaffolds” foi confirmada pela espectroscopia de infravermelhos por transformadas de Fourier (FTIR). A análise morfológica dos “scaffolds” foi baseada em microscopia electrónica de varrimento (SEM), microscopia óptica, bem como cortes histológicos. Os resultados obtidos demonstraram uma elevada porosidade, o que leva à dilatação da estrutura quando imersa em tampão fosfato salino (PBS). Os testes de degradação enzimática realizados, usando PBS e uma solução enzimática composta por lisozima e hialuronidase, demonstraram que a degradação dos “scaffolds” ocorreu de forma gradual e tal como esperado foi mais acentuada na solução enzimática. As propriedades mecânicas dos “scaffolds” foram avaliadas usando análise dinâmica mecânica (DMA). Os resultados revelaram que os “scaffolds” exibem um comportamento viscoelástico o que corrobora os resultados obtidos na QCM. A aplicabilidade destas estruturas para a cartilagem avaliou-se em ensaios celulares com bch e células humanas mesenquimais (hMSCs). Os testes de viabilidade celular, SEM e quantificação de DNA revelaram que os “scaffolds” promovem a adesão celular e proliferação. Estudos de diferenciação demonstraram a produção de glucosaminoglicanos (GAGs) de ambas as células. Estes resultados confirmam a manutenção de fenótipo dos bch e a diferenciação condrogénica de hMSCs. Desta forma, acreditamos que os “scaffolds” desenvolvidos terão uma potencial utilização em estratégias de TE para a cartilagem.