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TítuloDesenvolvimento na produção de proteínas recombinantes e respectivos anticorpos com interesse de diagnóstico e/ou terapêutico através de um novo sistema de fusão em Escherichia coli
AutorMarques, Armando Hugo Soares
OrientadorDomingues, Lucília
Almeida, André
Palavras-chaveProteínas recombinantes
Tag de fusão
Pal
Doença do legionário
Legionella pneumophila
Cromatografia de afinidade
Diálise
Anticorpos
ELISA
Blotting
Recombinant proteins
Fusion tag
Pal
Legionnaire’s disease
Legionella pneumophila
Affinity chromatography
Dialysis
Antibodies
Data2011
ResumoA Pal é uma lipoproteina que existe em maior abundância na parede celular da Legionella pneumophila. A localização e abundância da Pal tornam-na um antigénio importante no controlo de infecções causadas por este microrganismo. A obtenção desta proteína na sua estrutura nativa é, assim, importante para a produção de anticorpos que possam ser utilizados em testes de diagnóstico rápidos e na produção de vacinas. Tendo em conta o potencial de diagnóstico da Pal bem como a necessidade de uma produção proteica rápida e eficaz, estudou-se neste trabalho um novo sistema de produção de proteínas recombinantes em Escherichia coli e respectivos anticorpos: o tag de fusão H. Para isso procedeu-se ao estudo das condições óptimas de solubilidade da HPal em condições nativas, na E. coli e posteriormente passou-se ao aumento de escala e à purificação desta proteína através da cromatografia de afinidade. Posteriormente, procedeu-se à imunização dos animais com a HPal purificada ao longo de 15 dias e 25 dias. Findo esse tempo, recolheu-se o soro dos animais e procedeu-se à detecção dos anticorpos presentes no soro. A elaboração deste trabalho permitiu expressar de forma solúvel a HPal, usando 4 horas de indução, 1mM IPTG, a 37ºC. Além disso, foi possível equilibrar, lavar e eluir a proteína com 20 mM, 20 mM e 70 mM de imidazole, respectivamente. Apesar de apresentar alguns contaminantes, ficou também provado que o antigénio recombinante HPal induziu uma forte produção de anticorpos anti-Pal. O trabalho foi desenvolvido em estreita colaboração com a empresa Hitag Biotechnology, Lda.
The Pal is a lipoprotein that exists in greater abundance in the cell wall of Legionella Pneumophila. The location and abundance of Pal make it an important antigen in the control of infections caused by this microorganism. The achievement of this protein in its native structure is thus important for the production of antibodies that can be used in rapid diagnostic tests and vaccine production. Having regard to the diagnostic potential of Pal and the need for a rapid and efficient protein production, we studied in this work a new system for producing recombinant proteins in Escherichia coli and their antibodies: the fusion tag H. For this we proceeded to the study of optimal conditions for solubility of HPal in native conditions in E. coli and subsequently went to the scaling up and purification of this protein by affinity chromatography. Afterwards, if the immunization of animals with purified HPal over 15 days and 25 days. After this time, withdrew the serum of animals and proceeded to the detection of antibodies in serum. The preparation of this work allowed us to express the soluble form HPal, using four hours of induction, 1 mM IPTG at 37ºC. Moreover, it was possible to balance, wash and elute the protein with 20 mM, 20 mM and 70 mM imidazole, respectively. Despite showing some contaminants, it also proved that the HPal recombinant antigen induced strong production of anti-Pal. The work was developed in close collaboration with the company Hitag Biotechnology, Inc.
TipomasterThesis
DescriçãoDissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)
URIhttp://hdl.handle.net/1822/19909
AcessoopenAccess
Aparece nas coleções:BUM - Dissertações de Mestrado Integrado
CEB - Dissertações de Mestrado / MSc Dissertations

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