Microbial interactions on biofilm formation by drinking water autochthonous microorganisms

Abstract

The provision of safe drinking water (DW) is a top priority issue in any civilized society. Safe DW is a basic need to human development, health and well-being. The main challenge to the DW industry is to deliver a product that is microbiologically and chemically safe, aesthetically pleasing and adequate in quantity and delivery pressure. Normally, the water that leaves a treatment station has quality, but its quality decreases along the travel in the drinking water distribution systems (DWDS). It is well known that biofilms constitute one of the major microbial problems in DWDS that most contributes to the deterioration of water quality. However, their elimination from DWDS is almost impossible, but several aspects can be manipulated in order to prevent and control their growth. The main goal of this work is to provide a contribution to better understand the important biological and ecological mechanisms (adhesion, coaggregation, microbial diversity and interactions, chemical resistance) involved in biofilm formation in DWDS, with intent to control and prevent their formation, in order to improve DW quality. Thus, several aspects were studied namely: biofilm formation by DW autochthonous bacteria using bioreactors (effects of hydrodynamic conditions and support material); isolation and identification of the autochthonous bacteria present in local DW; studies on their adhesion and biofilm formation abilities (effects of bacteria and support material surface physicochemical properties); studies of coaggregation abilities and bacterial interspecies interactions involved in biofilm formation; detection of microbial secondary metabolites with antimicrobial and biofilm control properties; study on single and multispecies biofilm control with sodium hypochlorite (SHC) and microbial metabolites. The study of DW biofilm formation was performed in two distinct bioreactors, flow cell and PropellaTM, in order to study the influence of hydrodynamic conditions (turbulent and laminar flow) and support material (PVC and SS) on biofilm formation. The biofilms were monitorized over time in terms of total and cultivable bacteria. All the process conditions allowed the formation of biofilms. The biofilm formation in turbulent flow was similar in both bioreactors, regardless the adhesion surface tested. Under laminar flow, the Propella™ bioreactor allowed higher biofilm formation than the flow cell system. The biofilm formation in flow cell systems was higher on PVC surfaces than on SS. While, in PropellaTM system biofilm formation on PVC and SS was similar for both flow regimes. This work also allowed the isolation of distinct DW bacteria, which were identified; some of them were selected for the subsequent studies. Selected DW-isolated bacteria (25 phenotypically distinct) and some support materials commonly used in DW networks (SS304, SS316, copper, PP, PE, silicone and glass) were characterized in terms of surface properties (surface tension and hydrophobicity) by the contact angles measurement and their adhesion potential was studied by means of thermodynamic theory and by adhesion assays in microtiter plates. All bacteria were classified as hydrophilic and the materials as hydrophobic. SS304, copper, PP, PE and silicone thermodynamically favoured adhesion for the majority of the tested strains, whilst adhesion was generally less thermodynamically favourable for SS316, PVC and glass. Studies of adhesion shown that in addition to surface properties, biological characteristics and mechanisms can be involved in the early adhesion processes and may play a determinant role on the adhesion ability. Consequently, the study of adhesion only based on thermodynamic theory did not provide accurate and reliable results. This work also suggests that strongly adherent bacteria (A. calcoaceticus) may play a determinant role in primary colonization of surfaces and possibly on the initial biofilm formation in the real environments. Studies of adhesion and biofilm formation by six selected DW bacteria (A. calcoaceticus, B. cepacia, Methylobacterium sp., M. mucogenicum, Sph. capsulata and Staphylococcus sp.) were performed in order to characterize the relationships between the two phenomena. The adhesion was assessed by the methods referred above and biofilm formation was developed over time in microtiter plates. Adhesion and biofilm formation abilities were only correlated in the early stages of biofilm formation (24 h). For longer periods (48 and 72 h) some bacteria classified as non-adherent produced large amounts of matured biofilms. Initial adhesion did not predict the ability of the tested DW bacteria to form a mature biofilm, suggesting that other events such as phenotypic and genetic switch during biofilm development and the production of EPS may play a significant role on biofilm formation and differentiation. A. calcoaceticus, Methylobacterium sp. and M. mucogenicum were those bacteria with the ability to produce more biofilm. Intergeneric coaggregation ability between DW bacteria was studied (visual and microscopy methods) as well as the surface associated molecules (sugars and proteins) involved in this process. Also, the role of bridging bacteria in multispecies biofilm formation in microtiter plates was assessed. The results demonstrate that only A. calcoaceticus autoaggregated and coaggregated with four of the five tested bacteria (Methylobacterium sp. as exception). These cell-to-cell adhesion mechanisms were mediated by lectin-saccharide interactions. A. calcoaceticus exhibited a putative bridging function in multispecies biofilm formation, being their presence in biofilms a colonization advantage. Single and dual species biofilm formation, and specific activities, by DW bacteria were determined using microtiter plates over time in order to study the role of bacterial interactions on biofilm formation. A series of planktonic studies (assessing the bacterial growth rate, motility and production of quorum sensing inhibitors - QSI) were also performed in order to try to identify key attributes regulating microbial interactions. Evidences of synergy/cooperation, antagonism and neutral interactions were found between DW bacteria. B. cepacia had the highest growth rate and motility, and produced QSI. Methylobacterium sp., Sph. capsulata and Staphylococcus sp. also produced QSI. Only for Sph. capsulata-M. mucogenicum, Sph. capsulata-A. calcoaceticus and M. mucogenicum-Staphylococcus sp., dual biofilm formation seems to be regulated by the QSI produced by Sph. capsulata and Staphylococcus sp. and by the increased growth rate of Sph. capsulata. The chemical control of single and multispecies biofilms with SHC was studied in microtiter plates. The ability of biofilms to recover from disinfection was also assessed. Methylobacterium sp. and M. mucogenicum single species biofilms had the highest resistance to SHC, while Staphylocooccus sp. and A. calcoaceticus formed the most susceptible biofilms. In general, multispecies biofilms were more resistant to inactivation and removal than single biofilms. Multispecies biofilms with all the six bacteria had the highest resistance to SHC, while those without A. calcoaceticus were the most susceptible. Only biofilms without A. calcoaceticus were not able to recover their biomass from the SHC treatments. A. calcoaceticus has a key role in the resistance and functional resilience of DW biofilms (its presence in multispecies biofilms increase their resistance and their ability to recover). The effects of metabolite molecules on single and multispecies biofilm formation were also studied using microtiter plates. Moreover, some bacterial physiological aspects regulating interspecies interactions (planktonic and sessile growth rates, antimicrobial activity, production of QSI, QS molecules and iron chelators) were characterized with the intent to identify bacterial species with biocontrol potential. A. calcoaceticus, B. cepacia, Methylobacterium sp. and M. mucogenicum single species biofilms were strongly inhibited by the cell-free supernatants from the other bacteria. M. mucogenicum and Sph. capsulata cell-free supernatants demonstrated a high potential to inhibit the growth of counterpart biofilms. For multispecies biofilms only cell-free supernatants produced by B. cepacia and A. calcoaceticus had no inhibitory effects (caused potentiation) on biofilm formation. Multispecies biofilms were highly susceptible to metabolite molecules in the absence of A. calcoaceticus. In conclusion, the work developed in this thesis clearly reveals that A. calcoaceticus had the highest ability to adhere to surfaces, coaggregated with partner bacteria and provided resistance and resilience to control conditions. The presence of this bacterium in the tested consortium represented a significant colonization advantage. It seems strategic to consider the presence of this bacterium in the local DW system as a predictor of the presence of SHC resistant biofilms. Also, microbial species diversity association and interspecies interactions increased multispecies biofilm resistance and resilience to control conditions comparatively to single species biofilms.

O fornecimento de água potável (AP) é um assunto de prioridade máxima de qualquer sociedade civilizada. A AP é uma necessidade básica para o desenvolvimento humano, saúde e bem-estar. O principal desafio da indústria da água é fornecer um produto que é microbiologicamente e quimicamente seguro, esteticamente agradável e em quantidade e pressão adequadas. Normalmente, a água à saída da estação de tratamento tem qualidade, mas esta diminui ao longo do seu percurso no sistema de distribuição de água potável (SDAP). É sabido que os biofilmes constituem um dos principais problemas microbianos dos SDAP, que mais contribuem para a deterioração da qualidade da água. Contudo, a sua eliminação destes sistemas é quase impossível, mas vários aspectos podem ser manipulados de modo a prevenir e controlar o seu crescimento. O objectivo principal deste trabalho é contribuir para melhor entender os mecanismos, biológicos e ecológicos (adesão, coagregação, diversidade e interacções microbianas, resistência a antimicrobianos), envolvidos na formação de biofilme em SDAP, com o intuito de controlar e prevenir a sua formação, de modo a melhorar a qualidade da AP. Assim, vários aspectos foram estudados nomeadamente: a formação de biofilme por bactérias autóctones da AP, usando biorreactores (efeito das condições hidrodinâmicas e material suporte); isolamento e identificação das bactérias autóctones presentes na AP local; estudos da sua capacidade de adesão e formação de biofilme (efeito das propriedades físico-químicas da superfície das bactérias e materiais); estudos da capacidade de coagregação e interacções bacterianas inter-espécie envolvidas na formação de biofilme, detecção de metabolitos microbianos secundários com propriedades antimicrobianas e com potencialidade no controlo de biofilmes; estudo do controlo de biofilmes simples e multiespécie com hipoclorito de sódio (SHC) e metabolitos microbianos. O estudo da formação de biofilme foi efectuado em dois biorreactores diferentes, células de fluxo e PropellaTM, de modo a estudar a influência das condições hidrodinâmicas (escoamento turbulento e laminar) e materiais (PVC e SS) na formação de biofilme. Os biofilmes foram monitorizados ao longo do tempo em termos de bactérias totais e cultiváveis. Todas as condições permitiram a formação de biofilme. A formação de biofilme em escoamento turbulento foi semelhante nos dois biorreactores, independentemente do material. Em escoamento laminar, no PropellaTM obteve-se maior formação de biofilme que nas células de fluxo. A formação de biofilme nas células de fluxo foi maior em PVC do que em SS. Enquanto, no PropellaTM a formação de biofilme foi semelhante em PVC e SS para ambos os regimes de escoamento. Este trabalho também possibilitou o isolamento de diferentes bactérias da AP, as quais foram identificadas; algumas delas foram seleccionadas para os estudos posteriores. As bactérias da AP seleccionadas (25 fenotipicamente diferentes) e alguns materiais frequentemente usados nos SDAP (SS304, SS316, cobre, PP, PE, silicone e vidro) foram caracterizados de acordo com as propriedades superficiais (tensão superficial e hidrofobicidade) pela medição dos ângulos de contacto e o seu potencial de adesão foi estudado pela teoria termodinâmica e por ensaios de adesão em microplacas. Todas as bactérias foram classificadas como hidrofílicas e os materiais como hifrofóbicos. SS304, cobre, PP, PE e silicone favorecem termodinamicamente a adesão para a maioria das estirpes testadas, enquanto a adesão foi geralmente termodinamicamente menos favorável para o SS316, PVC e vidro. Os ensaios de adesão mostraram que para além das propriedades superficiais, as características e mecanismos biológicos podem estar envolvidos nos processos iniciais de adesão e podem ter um papel determinante na capacidade de adesão. Consequentemente, o estudo da adesão unicamente baseado na teoria termodinâmica não fornece resultados precisos e fiáveis. Este trabalho também sugere que bactérias com elevada capacidade de adesão (A. calcoaceticus) podem ter um papel decisivo na colonização primária de superfícies e possivelmente na formação inicial de biofilme em ambientes reais. Os estudos da capacidade de adesão e formação de biofilme por seis bactérias da AP seleccionadas (A. calcoaceticus, B. cepacia, Methylobacterium sp., M. mucogenicum, Sph. capsulata and Staphylococcus sp.) foram realizados para caracterizar as relações entre os dois fenómenos. A adesão foi avaliada pelos métodos acima referidos e a formação de biofilme foi efectuada ao longo do tempo em microplacas. A capacidade de adesão e formação de biofilme encontram-se apenas correlacionadas nas fases iniciais de formação de biofilme (24 h). Para períodos mais longos (48 e 72 h) algumas bactérias classificadas como não aderentes produziram grandes quantidades de biofilme maduro. A adesão inicial não prevê a capacidade das bactérias da AP formarem biofilmes maduros, sugerindo que outros eventos tais como alteração fenotípica e genética durante a formação de biofilme e a produção de EPS possam ter um papel importante na formação e diferenciação do biofilme. A. calcoaceticus, Methylobacterium sp. e M. mucogenicum foram as bactérias com maior capacidade de produção de biofilme. A capacidade de coagregação intergenérica entre as bactérias foi estudada (método visual e microscópico) bem como as moléculas da superfície (açúcares e proteínas) envolvidas nesse processo. Além disso, foi avaliado o papel de bactérias de ligação na formação de biofilmes multiespécie em microplacas. Os resultados demonstraram que apenas A. calcoaceticus autoagregou e coagregou com quatro das cinco bactérias testadas (excepção é Methylobacterium sp.). Este mecanismo de adesão celular é mediado por interacções lectinas-açúcares. A. calcoaceticus demonstrou uma possível função de ligação nos biofilmes multiespécie, sendo a sua presença nos biofilmes uma vantagem na colonização de superfícies. A formação de biofilmes simples e duplos pelas bactérias da AP, e respectivas actividades específicas, foram efectuados em microplacas ao longo do tempo, de modo a estudar o papel das interacções bacterianas na formação de biofilme. Uma série de estudos planctónicos (avaliação da taxa de crescimento, mobilidade e produção de moléculas inibidoras do quorum sensing - QSI) também foram realizados com o intuito de identificar atributos essenciais que regulam as interacções microbianas. Evidências de sinergia/cooperação, antagonismo e interacções neutras foram identificadas entre as bactérias. B. cepacia tem a maior taxa de crescimento e mobilidade, e produz QSI. Methylobacterium sp., Sph. capsulata e Staphylococcus sp. também produzem QSI. A formação de biofilmes duplos parece apenas ser regulada pelos QSI produzidos por Sph. capsulata e Staphylococcus sp. e a elevada taxa de crescimento de Sph. capsulata para os seguintes biofilmes: Sph. capsulata-M. mucogenicum, Sph. capsulata-A. calcoaceticus e M. mucogenicum-Staphylococcus sp. O controlo químico de biofilmes simples e multiespécie com SHC foi estudado em microplacas. A capacidade dos biofilmes recuperarem da desinfecção também foi avaliada. Os biofilmes simples de Methylobacterium sp. e M. mucogenicum tiveram a maior resistência a SHC, enquanto Staphylococcus sp. e A. calcoaceticus formam os biofilmes mais susceptíveis. Em geral, os biofilmes multiespécie foram mais resistentes à inactivação e remoção do que os simples. Os biofilmes multiespécie com as seis bactérias tiveram a maior resistência a SHC, enquanto os biofilmes sem A. calcoaceticus foram os mais susceptíveis. Apenas os biofilmes sem A. calcoaceticus não foram capazes de recuperar a sua biomassa após o tratamento com SHC. A. calcoaceticus tem um papel fundamental na resistência e resiliência dos biofilmes da AP (a sua presença nos biofilmes multiespécie aumenta a sua resistência e a sua capacidade de recuperação). Os efeitos dos metabolitos extracelulares na formação de biofilmes simples e multiespécie foram estudados em microplacas. Além disso, também foram caracterizados aspectos fisiológicos adicionais das bactérias que regulam as interacções inter-espécie (taxas de crescimento planctónico e séssil, actividade antimicrobiana, produção de QSI, moléculas QS, e chelantes de ferro) com o intuito de identificar espécies bacterianas com potencial biocontrolo. Os biofilmes simples de A. calcoaceticus, B. cepacia, Methylobacterium sp. e M. mucogenicum foram fortemente inibidos pelos sobrenadantes das outras bactérias. Os sobrenadantes da M. mucogenicum e Sph. capsulata demonstraram um elevado potencial para inibir o crescimento dos biofilmes das outras bactérias. Para os biofilmes multiespécie apenas os sobrenadantes produzidos por B. cepacia e A. calcoaceticus não tiveram efeitos inibitórios (causaram potenciação) na formação de biofilme. Os biofilmes multiespécie foram altamente susceptíveis aos metabolitos na ausência da A. calcoaceticus. Em conclusão, o trabalho desenvolvido nesta tese demonstra que A. calcoaceticus tem uma elevada capacidade de adesão e coagregação e apresenta resistência e resiliência a condições de controlo. A presença desta bactéria no consórcio estudado representa uma vantagem significativa de colonização. Parece ser estratégico reflectir sobre a presença desta bactéria no sistema local de AP como uma previsão da presença de biofilmes resistentes ao cloro. Além disso, a associação de diversas espécies microbianas e as interacções inter-espécie aumentam a resistência e resiliência dos biofilmes multiespécie comparativamente aos biofilmes simples.