Recombinant expression and activity of cationic antimicrobial peptides

Abstract

In the past 60 years, antibiotics have been critical in the fight against infectious disease caused by microorganisms. The increasing bacterial resistance to antibiotics is a serious public health problem. Much research has been dedicated to the development of new classes of antibiotics to overcome this situation. Antimicrobial peptides (AMPs) are generally defined as peptides of less than 50 amino acid residues, bearing positive charge due to multiple lysine and arginine residues and with 50% or more of hydrophobic residues. AMPs have aroused great interest due to their broad spectrum of antimicrobial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi, protozoa and some viruses and their ability to overcome bacterial resistance. The major problem for the chemical production of AMPs is the elevated cost. Recombinant expression techniques for large-scale production of these peptides would represent an economically more viable approach. Therefore, strategies to produce AMPs at affordable cost are much required for the exploitation of their therapeutic potential. This was one of the main objectives of this thesis: the recombinant production and purification of two AMPs (Magainin-2 and LL37) using a family 3 carbohydrate-binding module (CBM3) from Clostridium thermocellum as fusion partner. The use of the CBM3 could reduce the purification costs using cellulose as affinity matrix. The other purpose was to evaluate the biological activities of recombinant LL37 and its therapeutic effects in mice models of wound healing, after topical application. The general introduction of this thesis is presented in chapter 1 and includes a bibliographic revision of: 1) the antimicrobial peptides; 2) a brief revision of carbohydrate-binding modules and their potential as fusion partners; 3) The frog AMP magainin-2; 4) the human AMP LL37; and 5) the wound healing process. In chapter 2, the expression of the AMP magainin-2 (MAG2) is described. MAG2 was fused to the N- and C-termini of the CBM3 containing a linker sequence (LK-CBM3), and formic acid recognition site between the two modules, for chemical cleavage. The recombinant protein MAG2- LK-CBM3 was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and LK-CBM3-MAG2 in E. coli M15 (pREP4). The N-terminal MAG2 from the first construction was successfully cleaved and purified from the fusion partner LK-CBM3. However, the peptide showed no antibacterial activity against E. coli K12. The negatively charged C-terminal aspartic acid left from the acid cleavage may be the cause for the absence of antimicrobial activity. The expression of C-terminal MAG2 from the second construct was not successful. The peptide may have suffered proteolysis during the recombinant expression. Chapter 3 describes the expression of the human LL37. The protein was also cloned to the N- and C-termini of LK-CBM3 and a formic acid recognition site was introduced between the two modules, allowing the isolation of LL37 after chemical cleavage. The recombinant proteins were expressed in E. coli BL21 (DE3) and solubilized with Triton X-100. The purification was achieved using cellulose CF11 fibers, taking advantage of the CBM3 specific affinity for cellulose; after hydrolysis with formic acid, LL37 was further purified by reverse-phase HPLC. Only the recombinant LL37 obtained from the C-terminally fused protein (LK-CBM3-LL37) showed antibacterial activity against E. coli K12, with a MIC of 180 !g/ml. The biological activity of the recombinant P-LL37 with a N-terminus proline resulting from the chemical cleavage was confirmed in chapter 4. Also, wound healing experiments were performed in dexamethasone-treated mice to study the effect of LL37 on angiogenesis and wound regeneration. P-LL37 neutralized the activation of macrophages by lipopolysaccharide (LPS) and induced proliferation, migration and tubule-like structures formation by endothelial cells. The topical application of synthetic or recombinant LL37 on mice wounds increased vascularization and re-epithelialization, accelerating the healing process. After the confirmation that P-LL37 preserves its biological activities and accelerated wound healing, we tested the adjuvant activity of CRAMP and P-LL37 using Candida albicans protease Sap2 as antigen. We also evaluated the wound healing effects of topically added LL37 on diabetic mice. These experiments are described in the chapter 5. The administration of CRAMP or P-LL37 with Sap2 did not increase the production of Sap2-specific serum IgG antibody, i.e. no adjuvant activity was detected for both peptides. The topical application of LL37 on diabetic mice wounds did not accelerate the healing process very significantly. However, histological analysis after 13 days showed encouraging results. In fact, they revealed that the wounds treated with LL37 were smaller and presented several new skin annexa that could originate new hair, which may translate a more effective tissue regeneration.

Nos últimos 60 anos, os antibióticos têm sido cruciais no combate contra doenças infecciosas causadas por microrganismos. A resistência crescente destes microrganismos aos antibióticos tornou-se um sério problema de saúde pública. Para combater esta situação, muita investigação tem sido desenvolvida para produzir novos tipos de antibióticos. Os péptidos antimicrobianos (Antimicrobial Peptides - AMPs) são geralmente definidos como péptidos com menos de 50 aminoácidos, com carga positiva devido à presença de múltiplas lisinas e argininas e com mais de 50% de aminoácidos hidrofóbicos. Os AMPS têm gerado grande interesse pelo facto de apresentarem um largo espectro de atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, protozoários e pela capacidade de ultrapassarem os mecanismos de resistência a antibióticos. A síntese química para a produção de AMPs apresenta custos elevados; alternativamente, as técnicas de expressão recombinante podem ser mais viáveis, economicamente, para uma produção em larga escala, permitindo assim a introdução desta nova geração de antibióticos na prática clínica. Este foi então um dos principais objectivos desta tese: a produção recombinante de dois péptidos antimicrobianos (Magainina-2 e LL37) usando como proteína de fusão um domínio de ligação a carbohidratos de família 3 (Carbohydrate-binding module - CBM3), proveniente de Clostridium thermocellum. A utilização deste CBM3 poderá reduzir os custos do processo de purificação usando celulose com matriz de afinidade. O outro objectivo consistiu na avaliação das propriedades biológicas do péptido recombinante LL37 e o seu potencial terapêutico na cicatrização de feridas após aplicação tópica. A introdução geral desta tese está apresentada no capítulo 1 e inclui uma revisão bibliográfica de: 1) péptidos antimicrobianos; 2) uma breve revisão dos CBMs e do seu potencial como proteínas de fusão; 3) o AMP de rã magainina-2; 4) o AMP humano LL37; e 5) o processo de cicatrização/regeneração de feridas. O capítulo 2 descreve a clonagem do AMP magainina-2 (MAG2) nos lados N- e C-terminal do CBM3, incluindo o espaçador (LK-CBM3). Foi ainda introduzido na construção, entre os dois módulos, um local de reconhecimento para hidrólise química com ácido fórmico. A proteína recombinante MAG2-LK-CBM3 foi expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) e a proteína LKCBM3- MAG2 em E. coli M15 (pREP4). A MAG2 no N-terminal da primeira construção foi expressa, clivada e purificada com sucesso. No entanto, o péptido não apresentou atividade antimicrobiana contra E. coli K12. A presença de um resíduo carregado negativamente (aspartato) no lado C-terminal da MAG2, poderá causar a ausência de atividade. Este resíduo não está presente no péptido nativo, resultando da introdução da sequência aspartato-prolina na construção, para permitir a hidrólise ácida. A expressão da MAG2 no lado C-terminal do LK-CBM3 não teve sucesso. O péptido poderá ter sofrido proteólise durante a expressão em E. coli. No capítulo 3 descreve-se a expressão do AMP humano LL37. Este foi também clonado nos lados N- e C-terminal do LK-CBM3. De igual modo, introduziu-se o local para hidrólise química com ácido fórmico entre os dois módulos, para permitir a separação da LL37. As duas proteínas recombinantes foram expressas em E. coli BL21 (DE3) e solubilizadas com Triton X-100. A purificação foi efectuada usando fibras de celulose CF11, beneficiando da afinidade específica do CBM3 para este material; após hidrólise com ácido fórmico, LL37 foi purificada por RP-HPLC. A LL37 proveniente do C-terminal da proteína de fusão (LK-CBM3-LL37) foi a única a apresentar atividade antimicrobiana contra E. coli K12, com uma MIC de 180 !g/ml. As atividades biológicas do péptido recombinante P-LL37, com uma prolina no lado N-terminal resultante da hidrólise química, foram confirmadas no capítulo 4. Além disso, o efeito da LL37 na angiogénese e cicatrização de feridas foi avaliada em ratinhos tratados com dexametasona. PLL37 neutralizou a ativação de macrófagos por lipopolissacáridos e induziu a proliferação, migração e formação de vasos em células endoteliais. A aplicação tópica de LL37 sintética ou recombinante nas feridas de ratinhos aumentou a vascularização e re-epitelialização, acelerando o processo de cicatrização. Após ter sido confirmado que o péptido recombinante P-LL37 conserva as suas atividades biológicas e acelera o processo de cicatrização, foi testado o efeito adjuvante dos péptidos CRAMP e P-LL37 para efeitos de vacinação, usando a protease Sap2 de Candida albicans como antigénio. Além disso, foi avaliado o efeito da aplicação tópica de LL37 nas feridas de ratinhos diabéticos. Estas experiências estão descritas no capítulo 5. A administração de CRAMP ou PLL37 juntamente com Sap2 não aumentou a produção de anticorpos específicos anti-Sap2. Isto é, não foi detectada atividade adjuvante para nenhum dos dois péptidos. A aplicação tópica de LL37 nas feridas de ratinhos diabéticos não acelerou o processo de cicatrização de maneira muito significativa. No entanto, as análises histológicas das feridas após 13 dias revelaram dados encorajadores. De facto, estas análises mostraram que as feridas tratadas com LL37 eram menores e apresentavam vários anexos de pele que poderão originar novos pêlos, traduzindo uma mais eficiente regeneração dos tecidos.