Genetically engineered new spider silk chimeras for bone regeneration

Abstract

Tissue engineering and regenerative medicine are emerging fields focused on the development of tissues and organs that can be used in transplantation surgeries for the replacement or repair of damaged tissues or organs. This accomplishment would discard the need to use autologous and allogenic grafts, overcoming problems such as donor rejection, disease transmission or organ scarcity. The materials science field contributes directly for the achievement of this goal through the functionalization of natural or synthetic polymers or with the development of new biopolymers with diverse mechanical and biological characteristics. More recently, many research studies show the potential of using biotechnology approaches to generate new bioactive multifunctional materials engineered at the molecular level. An advantage of using genetically bioengineered biopolymers is the possibility of generating new genetic variants carrying different functional domains. The main goal of this thesis is to develop new multifunctional proteins that can be used in the fabrication of a new generation of biomaterials with improved features such as infection control, enhanced cell functions and better mechanical performance. As a result, the main objectives of this thesis are: I. Design of new functionalized spider silk fusion proteins through the combination of six repeats of the consensus unit for the native sequence of the major ampullate dragline silk I from Nephila clavipes (6mer) with two different types of proteins: bone sialoprotein (BSP) and the human antimicrobial peptides, namely human neutrophil defensin 2 (HNP‐2), human neutrophil defensins 4 (HNP‐4) and hepcidin. The four protein domains were fused with spider silk through recombinant DNA technology and the new chimeric proteins and silk alone were expressed in Escherichia coli RY‐3041 strain. 6mer, 6mer+BSP, 6mer+HNP‐2, 6mer+HNP‐4 and 6mer+hepcidin were purified with affinity chromatography and their identity was confirmed. II. Study the in vitro activity of the new chimeric proteins to verify if protein domains maintained their activity. Attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATRFTIR) results show that the spider silk domain, 6mer, maintained its ability to selforganize into a β‐sheet conformation, an important feature related with its mechanical properties. Additionally, in vitro mineralization studies demonstrated that 6mer+BSP fusion protein with BSP retained the ability to induce the deposition of CaP. Finally, radial diffusion tests showed that the antimicrobial domains present in 6mer+HNP‐2, 6mer+HNP‐4 and 6mer+Hepcidin proteins maintained bactericidal activity. III. Assess the mechanical properties and roughness of 6mer+BSP protein films and its behaviour in the presence of calcium ions. Since 6mer+BSP was synthesized for bone regeneration applications the study of these parameters is important. In this way, atomic force microscopy (AFM) was used for imaging and for force spectroscopy. The results obtained show that 6mer+BSP had a higher stiffness than 6mer protein. For both proteins the roughness values were similar. In the presence of Ca ions, the AFM imaging showed the ability of 6mer+BSP chimeric protein to form supramolecular networks through ionic crosslinking. IV. Address the in vitro activity of the new chimeric proteins. Cell culture studies with human mesenchymal stem cells (hMSC) indicated that 6mer+BSP protein sustained hMSC proliferation and differentiation into the osteogenic lineage. In the case of 6mer+HNP‐2, 6mer+HNP‐4 and 6mer+hepcidin proteins in vitro cell studies demonstrated that these new proteins were capable of sustaining the proliferation of mammalian osteosarcoma cell line (SaOs‐2). V. Finally, based on the results obtained with the in vitro, 6mer+BSP and 6mer+hepcidin were selected for in vivo studies and the results showed no major differences between the inflammatory responses to the 6mer+BSP and 6mer+Hepcidin films and the responses observed for the controls 6mer, poly‐lactic‐glycolic‐acid (PLGA) and empty implants. The results obtained in this thesis demonstrated that 6mer+BSP, 6mer+HNP‐2, 6mer+HNP‐4 and 6mer+hepcidin bioengineered proteins represent promising proteinbased biomaterial for future biomedical applications. Additionally, the results reported here also highlight the potential of using new genetically engineered proteins to develop new hybrid multifunctional biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine applications. This new generation of multifunctional proteins can combine different functionalities such as enhanced cell adhesion, mineral nucleation and infection control, and therefore exclude the need for additional chemical modification which has considerable disadvantages.

Engenharia de tecidos e medicina regenerativa têm como principal objectivo o desenvolvimento de estruturas para substituição de tecidos e órgãos danificados. Este feito excluiria a necessidade de utilizar implantes autólogos ou alogénicos, ultrapassando os problemas de rejeição e escassez de órgãos e de transmissão de doenças associados a este tipo de intervenções. A área de ciências dos materiais contribui directamente para o alcance deste objectivo através da funcionalização de polímeros naturais ou sintéticos e do desenvolvimento de novos polímeros. Estudos recentes mostram as vantagens do uso da biotecnologia na síntese de novos materiais bioactivos e multifuncionais. Os estudos descritos nesta tese centram‐se no uso da engenharia genética para o desenvolvimento de novas proteínas multifuncionais para aplicação no desenvolvimento de uma nova geração de materiais dotados de diversas características vantajosas tais como a capacidade de controlar infecções e de induzir melhores respostas a nível celular e propriedades mecânicas superiores. Desta forma, os principais objectivos desta tese são: I. Desenvolvimento de novas proteínas quiméricas através da fusão de seis unidadesconsenso da sequencia nativa da proteína ”major ampullate dragline silk I”, da espécie Nephila clavipes (6mer), com dois tipos diferentes de proteínas: sialoproteína do osso (BSP) e péptidos com propriedades antimicrobianas, “human neutrophil defensin 2” (HNP‐2), “human neutrophil defensins 4“(HNP‐4) and “hepcidin”. Utilizando a tecnologia de ADN recombinante, estes domínios proteicos foram fundidos com a sequência da seda e as novas proteínas foram expressas na estirpe de Escherichia coli RY‐3041. As proteínas 6mer, 6mer+BSP, 6mer+HNP‐2, 6mer+HNP‐4 e 6mer+hepcidin foram purificadas por cromatografia de afinidade e a sua identidade foi confirmada. II. Estudar, através de estudos in vitro, a actividade dos domínios proteicos das novas proteínas. As análises de infravermelho por transformada de Fourier com reflexão total atenuada (ATR‐FTIR) demonstram que o domínio da seda de aranha, 6mer, manteve a sua capacidade de auto‐organização em estruturas “β‐sheet”, imprescindível para as propriedades mecânicas desta proteína. Os testes de mineralização in vitro com a proteína 6mer+BSP mostram que o domínio BSP manteve a sua capacidade para induzir a deposição de fosfatos de cálcio. Os testes de difusão radial com 6mer+HNP‐2, 6mer+HNP‐4 e 6mer+hepcidin mostram que estas mantiveram a sua actividade anti‐bacteriana. III. Caracterização das propriedades mecânicas e da rugosidade das membranas de proteína 6mer+BSP, e do seu comportamento na presença dos iões de cálcio. Este estudo é importante na medida em que a proteína 6mer+BSP foi concebida para aplicações em osso. O microscópio de força atómica (AFM) foi utilizado para a colheita de imagens e para espectroscopia de força. Os resultados mostram que as membranas de 6mer+BSP são mais rígidas que as de 6mer. Os valores de rugosidade são semelhantes para ambos os tipos de membranas. Na presença de iões Ca2+ as imagens de AFM mostram que a proteína 6mer+BSP é capaz de formar complexos supramoleculares através de reticulação iónica. IV. Caracterização in vitro da resposta celular às novas proteínas. O estudo com células estaminais mesenquimais humanas (hMSC) indicaram que a proteína 6mer+BSP é capaz sustentar a sua proliferação e diferenciação osteogénica. Os testes com 6mer+HNP‐2, 6mer+HNP‐4 e 6mer+hepcidin mostram que estas proteínas sustentaram a proliferação de uma linha celular derivada de osteosarcoma de mamífero (SaOs‐2). V. Com base nos resultados obtidos as proteínas 6mer+BSP e 6mer+hepcidin foram seleccionadas para estudos in vivo. A comparação das respostas inflamatórias entre os implantes de 6mer+BSP e de 6mer+hepcidin e entre os controlos de 6mer, ácido poliláctico‐ glicólico (PLGA) e sem implante não mostrou diferenças significativas. Os resultados descritos nesta tese mostram que as proteínas 6mer+BSP, 6mer+HNP‐2, 6mer+HNP‐4 e 6mer+hepcidin, desenvolvidas através de engenharia genética, constituem promissores biomateriais proteicos para futuras aplicações na área biomédica. Estes resultados também destacam o potencial da engenharia genética no desenvolvimento de novas proteínas para o fabrico de novos materiais híbridos e multifuncionais para aplicação em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Estas proteínas combinam várias funcionalidades como melhor adesão celular, deposição de minerais e controlo de infecções, excluindo a necessidade de modificações químicas adicionais.