Listeria monocytogenes and salmonella enterica adhesion, biofilm formation and control

Abstract

Food contamination leads to wide economic loss and has a strong impact on public health worldwide. Listeria monocytogenes and Salmonella enterica Enteritidis are two of the most sight threatening and frequent foodborne pathogens, being responsible for listeriosis and salmonellosis foodborne outbreaks, respectively. The work presented in this thesis aimed at investigating adhesion and biofilm formation ability of these two bacteria regarding yet unexplored growth conditions and exposure to antimicrobials, as well as study possible repercussions of chemical disinfection on the genetic expression of virulence factors and stress response by surviving biofilm cells. L. monocytogenes has been a polemic bacterium as far as its biofilm formation capability is concerned, with different, and sometimes controversial, conclusions being stated by several authors. After testing this biological process under batch and fed-batch growth modes, both previously used by several authors but never compared simultaneously before, the results herein presented showed that the different growth modes influenced biofilm formation by L. monocytogenes on polystyrene, both in terms of biofilms’ total biomass and cellular viability. Temperature also played an important role on L. monocytogenes biofilm formation since refrigeration temperatures led to biofilms with less biomass but highly metabolic active, while at 37ºC biofilms had higher amount of biomass but were metabolically weaker. Surface coatings and antimicrobial incorporated materials have been two of the most promising attempts to produce new and improve already existing materials to be applied in food processing environments, in order to prevent microbial contaminations. A nitrogen-doped titanium dioxide coating on glass and on stainless steel was tested and showed to have bactericidal effect upon L. monocytogenes after only 30 minutes irradiation with visible light (fluorescent and/or incandescent light), when compared to non-coated surfaces. This fact indicated that such coated materials are likely to be applied on food contact surfaces as a means to reduce the risk of bacterial colonization and, thus, to improve food safety. The action of incorporated triclosan was assessed through S. enterica adhesion and biofilm formation on yet poorly studied food contact materials - stones. In this way, silestones (artificial stones mainly made of quartz, with triclosan incorporated) were tested and their performance compared with regular bench cover stones (granite and marble, without any antimicrobial compound) and stainless steel (one of the most commonly found surfaces in food processing environments). Similar levels of bacterial colonization and biofilm formation were observed on all materials, and lower numbers of S. enterica viable-culturable cells were found within biofilms formed on silestones. This indicates that, despite having shown some bactericidal effect upon biofilm cells, triclosan incorporated in silestones did not prevent bacterial colonization or biofilm formation. Once means to prevent contamination have failed and biofilms had already colonized the food contact surfaces, or in those cases where it is practically impossible to avoid microbial colonization during food processing, the greater concern becomes the surface cleaning through disinfection. In this work, susceptibility of L. monocytogenes and S. enterica monoculture-biofilms to disinfection was evaluated by determining the minimum biofilm eradication concentration (MBEC) of four distinct disinfectants commonly used in food industry – sodium hypochlorite, benzalkonium chloride, hydrogen peroxide and triclosan. Biofilm from both bacterial species were more susceptible to sodium hypochlorite than to any other disinfectant, whereas S. enterica biofilms were found to resist to triclosan’s action. Moreover, these assays revealed L. monocytogenes biofilms to be more susceptible to disinfection than S. enterica biofilms, which MBEC mean values concerning each disinfectant were higher than those found by the former bacterium. In order to investigate if disinfection had genetic repercussions on these biofilms, more specifically regarding stress-response and virulence genes expression by the surviving cells, quantitative real-time polymerase chain reaction was performed. Significant up-regulations were observed for L. monocytogenes and S. enterica stress-response genes cplC and ropS, respectively, as well as for S. enterica virulence gene avrA. These findings bring to discussion the fact that, even at concentrations that are able to significantly reduce biofilms biomass, chemical disinfectants seem to induce genetic alterations on the surviving cells that might not only lead to a stress response but, and even more worrying, may also increase their virulence.

A contaminação de alimentos não só leva a grandes perdas a nível económico como tem também um forte impacto negativo na saúde pública em todo o mundo. Listeria monocytogenes e Salmonella enterica Enteritidis são dois dos patogénicos alimentares mais perigosos e frequentes, sendo responsáveis por surtos de listeriose e salmonelose alimentar, respectivamente. O trabalho apresentado nesta tese teve como objectivo estudar a capacidade de adesão e de formação de biofilme por parte de ambas as espécies mencionadas tendo em consideração condições de crescimento e exposição a agentes antimicrobianos, até então não investigados, assim como analisar possíveis repercussões que a desinfecção química possa ter a nível de expressão de genes de resposta ao stresse e de virulência por parte de células de biofilme sobreviventes. Tem havido alguma controvérsia no que respeita à capacidade de formação de biofilme da espécie L. monocytogenes, com vários autores a apresentar conclusões diferentes, e por vezes contraditórias, sobre esta matéria. Após testar o efeito de dois modos de crescimento – em sistema fechado e com alimentação escalonada (ambos usados previamente por vários autores mas que nunca tinham sido comparados simultaneamente) -, os resultados aqui apresentados mostraram que os diferentes modos de crescimento influenciaram a formação de biofilme de L. monocytogenes em poliestireno, quer em termos de biomassa total como também a nível da viabilidade celular dos biofilmes. A temperatura também desempenhou um papel importante na formação de biofilmes de L. monocytogenes, dado que à temperatura de refrigeração formou-se biofilmes com menos biomassa mas metabolicamente muito activos, enquanto que a 37ºC formou-se biofilmes com mais biomassa mas metabolicamente mais fracos. O revestimento de superfícies e a incorporação de antimicrobianos em materiais têm sido duas das tentativas mais promissoras para produção de novos materiais, e melhoria dos já existentes, para aplicação em meios de processamento de alimentos. Neste contexto, foi testado um revestimento de dióxido de titânio com azoto em vidro e em aço inoxidável, o qual mostrou ter efeito bactericida sobre a L. monocytogenes após apenas 30 minutos de irradiação com luz visível (fluorescente e/ou incandescente) quando comparado com superfícies não-revestidas Este facto indica que tais materiais são passíveis de serem aplicados em superfícies de contacto com os alimentos como forma de reduzir o risco de colonização bacteriana e, assim, melhorar a segurança alimentar. A acção do triclosano incorporado foi avaliada através da capacidade de adesão e de formação de biofilme de S. enterica em materiais de contacto com alimentos ainda pouco estudados – as pedras. Para tal, testou-se o desempenho de silestones (pedras artificiais constituídas maioritariamente por quartzo, com triclosan incorporado) comparando-o com pedras comuns usadas em bancadas de cozinha (granito e mármore, sem qualquer composto antimicrobiano) e aço inoxidável (uma das superficies mais frequentemente encontradas em meios de processamento de alimentos). Verificaram-se níveis semelhantes de colonização bacteriana e formação de biofilme em todos os materiais e que o número de células viáveiscultiváveis de S. enterica foi mais baixo nos biofilmes formados nos silestones. Isto indica que, embora tendo algum efeito bactericida sobre as células do biofilme, o triclosan incorporado nos silestones não preveniu a colonização bacteriana nem a formação de biofilme. Uma vez falhadas as medidas de prevenção de contaminação e colonizadas por biofilmes as superfícies de contacto com alimentos, ou nos casos em que é praticamente impossível evitar a colonização microbiana durante o processamento dos alimentos, a maior preocupação torna-se a limpeza de superfícies através da desinfecção. Neste trabalho, avaliou-se a susceptibilidade à desinfecção por parte de biofilmes simples de L. monocytogenes e S. enterica por meio da determinação da concentração mínima de erradicação de biofilme (CMEB) de quatro desinfectantes diferentes frequentemente usados na indústria alimentar – hipoclorito de sódio, cloreto de benzalcónio, peróxido de hidrogénio e triclosano. Os biofilmes de ambas as espécies bacterianas foram mais susceptíveis ao hipoclorito de sódio do que a qualquer outro desinfectante, tendo-se ainda verificado alguma resistência por parte dos biofilmes de S. enterica à acção do triclosano. Além disso, estes ensaios revelaram uma maior susceptibilidade à desinfecção por parte dos biofilmes de L. monocytogenes comparativamente com os biofilmes de S. enterica, cujos valores médios de CMEB de cada desinfectante foram maiores do que os registados para a primeira bactéria. De modo a investigar-se se a desinfecção teve repercussões genéticas nestes biofilmes, mais especificamente no que respeita à expressão de genes de resposta ao stress e de virulência por parte das células sobreviventes, realizaram-se reacções quantitativas em cadeia da polimerase em tempo-real. Verificou-se a sobre-expressão significativa dos genes de resposta ao stress cplC e rpoS de L. monocytogenes e S. enterica, respectivamente, assim como do gene de virulência avrA de S. enterica. Estas descobertas levantam a questão de que, mesmo submetidas a concentrações de desinfectante capazes de reduzir significativamente a biomassa dos biofilmes, as células sobreviventes parecem sofrer alterações genéticas relacionadas não só com a uma reposta ao stresse mas também, e mais preocupante ainda, com um possível aumento da sua virulência.