Molecular epidemiology studies of candidiasis in oncological patients and development of new polymorphic microsatellite markers to distinguish Candida parapsilosis strains and investigate genetic diversity

Abstract

As infecções fúngicas constituem um problema relevante em hospitais de todo o mundo. A fácil transmissão dos fungos através do ar ou pelo contacto directo ou indirecto com pessoas, superfícies ou objectos contaminados conduz a uma crescente preocupação principalmente em pacientes imunodeprimidos. Os doentes oncológicos são um dos grupos mais sujeitos a infecções fúngicas, nomeadamente causadas por leveduras do género Candida. Os dados epidemiológicos disponíveis em Portugal sobre candidemia são escassos e, como tal, o objectivo geral deste trabalho foi estudar o status epidemiológico do nosso país no que respeita às colonizações, infecções por Candida e candidemia em pacientes oncológicos. Além disso, considerando a grande relevância de C. parapsilosis como agente etiológico de infecções sistémicas e de surtos hospitalares, o objectivo específico deste trabalho foi descrever e caracterizar novos marcadores moleculares baseados em regiões de DNA microssatélite que permitissem distinguir estirpes de C. parapsilosis e investigar a sua diversidade genética. Na primeira parte deste trabalho, efectuou-se um estudo sobre a incidência de candidemia num hospital oncológico Português. Verificou-se ser C. albicans a levedura mais frequentemente isolada, seguida de C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei e C. glabrata. Estirpes de Saccharomyces cerevisiae e Rhodotorula mucilaginosa foram também isoladas. Candida albicans foi isolada mais frequentemente em pacientes com tumores sólidos, nomeadamente da mama e dos tractos gastrointestinal e genitourinário (p=0.005), enquanto outras espécies de Candida são mais frequentemente isoladas de pacientes hematológicos (p=0.007). A taxa de mortalidade associada a candidemia foi de 31.9% (p=0.016). Todos os isolados de C. albicans e C. parapsilosis foram susceptíveis ao fluconazol, voriconazol e itraconazol. Resistência à caspofungina foi apenas observada em isolados de C. albicans e R. mucilaginosa. Todas as estirpes de C. parapsilosis mostraram-se susceptíveis ao posaconazol mas foram detectadas estirpes de C. albicans, C. tropicalis, C. krusei e C. glabrata resistentes a este antifúngico. Este estudo facultou informações úteis e importantes sobre a epidemiologia local de candidemia em pacientes oncológicos. Com o intuito de avaliar o risco de infecção endógena nestes pacientes, os resultados obtidos em culturas de rotina de 345 pacientes deste mesmo hospital foram analisados. A expectoração e as secreções brônquicas foram os produtos mais contaminados, com 28.9% do total de leveduras isoladas. A Gastrenterologia foi a unidade hospitalar donde provieram maior número de isolados, seguida da Hematologia. Também neste estudo C. albicans foi a espécie mais frequentemente isolada, sendo a incidência de C. parapsilosis bastante menor do que nos casos de candidemia. Não foi encontrada associação positiva entre as espécies de leveduras e o produto biológico analisado ou entre as espécies de leveduras e a unidade hospitalar. Como o ambiente hospitalar tem um papel crucial na epidemiologia das infecções fúngicas nosocomiais, a carga fúngica ambiental da Unidade de Hematologia foi avaliada com o intuito de determinar a diversidade fúngica e o seu potencial risco de infecção. No total, e durante quatro diferentes períodos de colheita, foram analisadas 304 superfícies, bem como as mãos do pessoal hospitalar dessa mesma unidade. As espécies mais frequentemente isoladas das superfícies foram Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Chrysonilia sitophila, Candida spp e Rhodotorula spp., enquanto Aspergillus spp. e Rhizopus arrhizus foram isoladas com mais frequência do ar. No que respeita aos resultados obtidos nas colheitas das mãos do pessoal hospitalar, foram isoladas espécies relacionadas com infecções da pele e unhas como Trichophyton spp., Fusarium spp., Scytalidium dimidiatum e Chrysosporium spp., tendo C. parapsilosis sido a levedura mais frequentemente encontrada. A amostragem efectuada antes e depois da lavagem das mãos mostrou que uma desinfecção adequada era 100% eficaz na remoção de microrganismos. Quatro novos loci polimórficos de DNA microssatélite úteis na distinção de isolados de C. parapsilosis foram identificados e usados na distinção de 233 isolados independentes de C. parapsilosis sensu stricto. Em análise multiplex, obtiveram-se 192 genótipos multilocus diferentes, tendo-se determinado um poder discriminatório combinado de 0.99, o mais alto descrito até hoje. Realizou-se a comparação dos genótipos obtidos por genotipagem microssatélite com os obtidos por RAPD, RFLP e ITS e verificou-se que a primeira conseguia distinguir todos isolados, enquanto os outros métodos não. Utilizando o método de genotipagem desenvolvido, observou-se que em casos de isolados múltiplos do mesmo paciente o genótipo multilocus de estirpes colonizadoras e causadoras de infecção é, de forma geral, mantido. O mesmo genótipo multilocus ou muito similar foi também encontrado em estirpes isoladas de superfícies hospitalares, mãos do pessoal hospitalar e pacientes internados. O alto grau de similitude genética entre estes isolados indica uma possível via de transmissão da estirpe através das mãos do pessoal hospitalar e de superfícies contaminadas, como maçanetas e carros de tratamento. Demonstrou-se assim que este método pode ser uma ferramenta valiosa em investigações epidemiológicas. Isolados clínicos e ambientais e de diferentes genótipos multilocus foram seleccionados e testados no que respeita à sua capacidade de produzir pseudo-hifas, resistir à fagocitose e morte intracelular, e capacidade de causar dano em macrófagos, medida pela libertação de lactato desidrogenase. A produção de TNF-α pelos macrófagos após incubação com as estirpes seleccionadas foi também quantificada. Observaram-se diferenças significativas entre isolados ambientais e clínicos, causando os primeiros, maior dano nos macrófagos e uma menor produção de TNF-α. Isolados das espécies geneticamente relacionadas C. orthopsilosis e C. metapsilosis mostraram ser menos citotóxicas para os macrófagos. Contrariamente ao descrito para C. albicans, não se demonstrou associação entre formação de pseudo-hifas e dano celular. O controlo das infecções nosocomiais por Candida requer um conhecimento aprofundado quer da estirpe infectante quer do estado imunológico do paciente. Este conhecimento, para o qual este trabalho visa contribuir, abre a possibilidade de pesquisas futuras neste campo.

Fungal infections constitute a relevant problem in hospitals from all over the world. Their easy transmission through the air or by direct or indirect contact with contaminated persons, surfaces or objects lead to an increasing preoccupation with those infections, particularly in immunocompromised patients. Amongst them, cancer patients are one of the risk groups in acquiring fungal infections, namely caused by yeasts belonging to genus Candida. Epidemiological data on candidemia in our country is scarce therefore the overall objectives of this work were to study the epidemiological status of Candida infection such as colonization, cross-transmission, and candidemia in Portuguese cancer patients. Furthermore, and regarding the enormous importance of C. parapsilosis as agent of bloodstream infections and hospital outbreaks a specific objective was to describe and characterize new polymorphic microsatellite markers able to distinguish among C. parapsilosis strains and to investigate genetic diversity. In the first part of this work incidence of candidemia in a Portuguese oncology hospital during a 6-year period was evaluated. The most frequent species found was C. albicans, followed by C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei and C. glabrata, but Saccharomyces cerevisiae and Rhodotorula mucilaginosa were also isolated. Candida albicans was more frequently associated with solid tumors of the gastrointestinal and genitourinary tracts and breast (p=0.005), while other species were most frequently recovered from hematological patients (p=0.007). The mortality rate associated with candidemia was 31.9% (p=0.016). All C. albicans and C. parapsilosis isolates were susceptible to fluconazole, voriconazole and itraconazole. Resistance to caspofungin was only observed in C. albicans and in the R. mucilaginosa isolates. Posaconazole was active against all C. parapsilosis isolates tested but resistant strains were found among C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, and C. glabrata. This study provided useful information about the local epidemiology of candidemia in cancer patients, and to evaluate the risk of endogenous infections the results of surveillance cultures from 345 patients of the same hospital were analyzed. Sputum and bronchial secretions were the most contaminated, with 28.9% of the total yeast isolates. Gastroenterology was the hospital ward with more isolates obtained, followed by the Hematology Unit. Again, the most frequently isolated species was C. albicans, but the incidence of C. parapsilosis was much lower than it was found for the candidemia episodes. No positive association was seen between yeast species and biological products or between yeast species and hospital ward. As hospital environment plays a crucial role in the epidemiology of nosocomial fungal infections the environmental fungal burden of the Hematology unit of the Hospital was evaluated in order to determine fungal diversity and potential risk for infection. In total, 304 surfaces were analyzed, in four different collection periods, as well as hands of healthcare workers of the same unit. The most frequent species isolated from surfaces were Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Chrysonilia sitophila, Candida spp and Rhodotorula spp while from the air, Aspergillus spp. and Rhizopus arrhizus were the most frequently found. In what respects the hands of heath care workers, species related with skin and nail infections like Trichophyton spp., Fusarium spp., Scytalidium dimidiatum and Chrysosporium spp were isolated, among others, and C. parapsilosis was also frequently isolated. Sampling before and after hand washing showed that hand hygiene compliance was 100% effective. Four new polymorphic microsatellite loci able to distinguish among C. parapsilosis isolates were identified and used to genotype 233 independent C. parapsilosis sensu stricto isolates. In a multiplex analysis, 192 genotypes were obtained and the combined discriminatory power of the four microsatellites was 0.99, the highest reported. Comparison of the genotypes obtained by microsatellite analysis and those obtained by RAPD, RFLP and ITS grouping was performed and showed that the microsatellite method could distinguish individual isolates while none of the other methods could. Using the developed microsatellite genotyping methodology it was observed that in cases of multiple isolates from the same patient the multilocus genotype of colonizing and bloodstream isolates was mainly maintained. The same or very similar multilocus genotypes were also found among isolates from hospital surfaces, from the hands of health care workers and from patients. High degree of genetic similarity was found among isolates collected from the hospital environment, hands of healthcare workers and from the patients, indicating that the possible route of transmission of C. parapsilosis is through the hands of healthcare workers and the contaminated medical trolleys and doors knobs. We demonstrate that this typing method is able to distinguish clonal clusters from genetically unrelated genotypes and can be a valuable tool to support epidemiological investigations. Selected C. parapsilosis isolates from clinical and environmental origins and different microsatellite multilocus genotypes were studied regarding their ability to produce pseudohyphae, to resist to phagocytosis and intracellular killing and to cause macrophage damage, measured by lactate dehydrogenase release. Quantification of TNFα production by macrophages upon incubation with the isolates was also performed. Significant differences amongst environmental and clinical isolates were observed, the first being able to cause higher macrophage damage and less induction of TNFα production. Isolates of the genetically related species C. orthopsilosis and C. metapsilosis were found to be less cytotoxic to host cells. Contrarily to what is described for C. albicans, association between pseudohyphae production and host cellular damage was not observed. Control of nosocomial infections due to Candida species requires both fundamental knowledge about the infecting yeast and of the characteristics and immunological status of the patient. This knowledge, to which the present work aimed to contribute, opens up the possibility for future research in this field.