Depleção do DNA mitocondrial: estudo de 14 doentes

Abstract

Nos últimos 30 anos, um largo espectro de doenças multissistémicas associadas a disfunções da mitocôndria, designando-se globalmente de citopatias mitocondriais, têm sido referenciadas, com sintomatologia desde o período neonatal até à idade adulta. Estas disfunções podem afectar qualquer órgão ou tecido do organismo, embora os músculos esquelético e cardíaco e o Sistema Nervoso Central (SNC) sejam os mais afectados, devido à sua elevada dependência do metabolismo energético. O Síndrome de Depleção Mitocondrial (MDS) é um grupo clinicamente heterogéneo de doenças mitocondriais caracterizado por uma redução parcial ou total do número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) nos tecidos afectados. O seu mecanismo patogénico está relacionado com a manutenção do pool de nucleótidos mitocondriais, que assume um papel crucial na replicação e integridade do mtDNA. São conhecidas três formas clínicas de MDS: miopática, hepatocerebral e encefalomiopática. O principal objectivo deste estudo, foi a implementação das técnicas de Southern blot e PCR quantitativo em tempo real (qtRT-PCR), para o estudo da depleção do mtDNA, bem como o estudo molecular dos genes DGUOK e TK2, por sequenciação automática. Estes codificam enzimas mitocondriais envolvidas na síntese de mtDNA via suplemento de deoxiribonucleotídios (dNTPs). A escolha destes genes baseou-se no grande número de mutações já descritas, associadas ao MDS. Foram estudados 14 doentes clinicamente suspeitos de MDS, tendo sido identificada uma mutação patogénica em heterozigotia no gene DGUOK, já descrita na literatura, num dos doentes deste estudo. Foi ainda possível identificar vários polimorfismos nos dois genes estudados, sendo que dois deles não estão descritos na literatura. A optimização das técnicas utilizadas, permitiu concluir que o qtRT-PCR, é uma técnica mais rápida, sensível e específica que o Southern blot, podendo ser vantajosa para um melhor e mais preciso diagnóstico da depleção do mtDNA.

In the last 30 years, a large spectrum of multisystemic disorders associated with mitochondrial dysfunction, have been described, with symptoms since neonatal period to late adult life. Although tissues with a high demand for oxidative phosphorilation such as brain and skeletal muscle are frequently affected, virtually any tissue can be involved. Because of that, multisystemic mitochondrial diseases are often referred to as mitochondrial encephalomyopathies, or in a larger concept, as mitochondrial cytophaties. The Mitochondrial Depletion Syndrome (MDS) is a clinically heterogeneous group of mitochondrial diseases characterized by a reduced number of copies of mitochondrial DNA (mtDNA) in the affected tissues. Its pathogenic mechanism is related with mitochondrial nucleotide pool maintenance, which plays a crucial role in mtDNA replication and integrity. Three clinical forms of MDS are known: myopathic, hepatocerebral and encephalomyopathic. The aim of this study was the implementation of Southern blot and Quantitative Real Time PCR (qtRT-PCR) techniques for the study of mtDNA reduction, beyond the molecular study of DGUOK and TK2, through automatic sequencing. These two genes, encode mitochondrial kinases, involved in mtDNA synthesis by supplement of deoxiribonucleotides (dNTPs). These genes were chosen because of large number of mutations already described, associated with MDS We studied 14 patients clinically suspected of having MDS. One pathogenic mutation in heterozigoty in DGUOK gene already described in literature was identified. It was also possible to identify several polymorphisms in the two genes studied, two of which for the first time. The optimization of the techniques used allowed us to conclude that qtRT-PCR is a more sensitive, fast and specific technique than Southern blot, and thus more appropriate for a better and more accurate diagnosis of mtDNA depletion.